Новини

Традиционните диагностични стратегии за откриване на инфекциозни заболявания изискват използването на настолни инструменти, които не са подходящи за тестване на място (POCT).Новата микрофлуидика е силно миниатюризирана, автоматизирана и интегрирана технология, която е потенциална алтернатива на традиционните методи за бърза, евтина и точна диагностика на място.Методите за молекулярна диагностика се използват широко в микрофлуидните устройства като най-ефективните методи за откриване на патогени.Този преглед обобщава последните постижения в базираната на микрофлуиди молекулярна диагностика на инфекциозни заболявания както от академична, така и от индустриална гледна точка.Първо, ние описваме типична обработка на нуклеинови киселини в чип, включително предварителна обработка на пробата, амплификация и четене на сигнала.След това се сравняват характеристиките, предимствата и недостатъците на четирите вида микрофлуидни платформи.След това ще обсъдим използването на цифрови анализи за абсолютното количествено определяне на нуклеиновите киселини.Както класическите, така и последните търговски микрофлуидни базирани молекулярни диагностични устройства са обобщени като доказателство за текущото състояние на пазара.И накрая, предлагаме бъдещи насоки за микрофлуидна диагностика на инфекциозни заболявания.
Инфекциозните заболявания се причиняват от патогени, включително бактерии, вируси и паразити, които са разпространени по целия свят.За разлика от други заболявания, патогените бързо се заразяват и се разпространяват между хората и животните гостоприемници чрез инокулация, въздушна и водна среда [1].Превенцията на инфекциозните заболявания е от решаващо значение като мярка за обществено здраве.Три основни стратегии за борба с инфекциозните заболявания: (1) контрол на източника на инфекция;(2) прекъсване на пътя на предаване;(3) защита на податливите популации.Сред основните стратегии, контролът на източника на инфекция се счита за най-важната стратегия поради нейното удобство и ниска цена.Бързата диагностика, изолацията и лечението на заразените лица са критични, изискващи бързи, чувствителни и точни диагностични стратегии [2].Текущата диагностика на инфекциозни заболявания обикновено съчетава клиничен преглед въз основа на признаци и симптоми и лабораторни изследвания като клетъчна култура и молекулярна диагностика, които изискват обучен персонал, трудоемки процедури и скъпо оборудване за тестване [3, 4].Предотвратяването на огнища на инфекциозни заболявания изисква бърза, евтина и точна локална диагностика, особено в райони с ограничени ресурси, където инфекциозните заболявания са чести и тежки [5], както и лечение в пустинята или на бойното поле, където извънредните ситуации са непредвидими..медицинското обслужване е ограничено [6].В този контекст микрофлуидиката е технология, която съчетава технологии на микроелектромеханични системи, нанотехнологии или наука за материалите за прецизно манипулиране на течности [7,8,9,10], предоставяйки нови възможности за откриване на място (POCT).) инфекциозни агенти извън болници и лаборатории.В сравнение с традиционната отнемаща време диагностика, микрофлуидната технология предлага спестяване на проби и разходи за молекулярна диагностика по време на епидемии от заболяване.Глобалното разпространение на коронавирусната болест 2019 (COVID-19) се причинява от тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), така че отново се подчертава значението на микрофлуидите за навременна превенция и контрол на пандемията [11, 12]. , 13].За разлика от традиционната диагностика, микрофлуидната POCT използва малки преносими устройства, вариращи от настолни анализатори до малки странични тест ленти за тестване близо до точката за вземане на проби [14].Тези тестове се отличават с опростена или без подготовка на пробата, бързо усилване на сигнала и чувствителни отчитания на сигнала, което води до кратка продължителност и точни резултати в рамките на минути.Наличието и масовото производство на базирани на микрофлуиди здравни инструменти разшириха техните икономически ефективни и директни диагностични приложения извън болницата, близо до пациента и дори у дома.
Сред съществуващите стратегии за диагностициране на инфекциозни заболявания, молекулярната диагностика е една от най-чувствителните [15, 16].В допълнение, молекулярната диагностика често се използва като златен стандарт за непрекъснато откриване на COVID-19, позволявайки директно откриване на специфични за вируса региони на РНК или ДНК преди началото на имунен отговор [17, 18].В настоящия преглед представяме най-новите постижения в базираните на микрофлуиди молекулярни диагностични процеси за инфекциозни заболявания, от академична гледна точка до бъдещи промишлени перспективи (фиг. 1).Ще започнем с три ключови стъпки в откриването на нуклеинова киселина: предварителна обработка на проба върху чип, амплификация на нуклеинова киселина и четене на сигнала.След това сравнихме различни видове микрофлуидни платформи с тяхната структура и функция, показвайки уникални характеристики (силни и слаби страни).Дигиталното откриване на нуклеинова киселина се обсъжда допълнително и се дава като пример за технология от трето поколение за абсолютно количествено определяне на молекули на инфекциозни патогени.Освен това ще бъдат представени няколко типични и най-нови комерсиални POCT устройства, за да демонстрират текущото състояние на микрофлуидния POCT пазар за молекулярна диагностика.Също така ще обсъдим и обясним нашата визия за бъдещи приложения.
Модулите на микрофлуидни чипове за откриване на нуклеинова киселина могат да бъдат разделени на три категории (вземане на проби, разпознаване и сигнализиране) според техните функции [19].Сред тези модули, модулът за вземане на проби основно реализира лизис на пробата и екстракция на нуклеинова киселина.Сензорният модул контролира главно преобразуването и усилването на сигнали от нуклеинова киселина.Сигнализиращият модул открива сигнала, преобразуван и обработен от сензорния модул.Въз основа на процеса на откриване на нуклеинови киселини в чип, ние ще обобщим различните чипове, които могат да реализират функцията „вход и изход“.
Първата стъпка в откриването на нуклеинова киселина е екстракцията на нуклеинова киселина, т.е. изолирането на целевата нуклеинова киселина от оригиналната проба.Екстракцията на нуклеинова киселина се извършва за пречистване на нуклеиновите киселини от други молекулни замърсители, осигуряване на целостта на първичната структура на молекулите на нуклеинова киселина и оптимизиране на резултатите.Екстракцията на нуклеинова киселина изисква необходимия лизис на пробата и улавяне на нуклеинова киселина, качеството и ефективността на които имат огромно влияние върху резултатите от изследванията и диагностиката.Всички фини странични ефекти по време на екстракцията могат да ограничат по-нататъшното откриване.Например, методите на полимеразната верижна реакция (PCR) и изотермичната амплификация на цикъла (LAMP) се инхибират от някои остатъчни органични разтворители като етанол и изопропанол в реагентите за изолиране на нуклеинова киселина [20].Екстракцията течност-течност и екстракцията в твърда фаза са най-популярните методи за изолиране на нуклеинови киселини [21], но екстракцията течност-течност върху чип е изключително ограничена, тъй като реагентите, използвани при екстракцията течност-течност, причиняват корозия на повечето микрофлуидни чипове .Тук подчертаваме методите за екстракция на твърда фаза, базирани на микрочипове, и сравняваме техните предимства и недостатъци.
Силицият е субстратен материал, съвместим с нуклеиновите киселини поради своята биосъвместимост, стабилност и лекота на модификация [22].Важно е, че когато се модифицира със силициев диоксид или други материали, този композит проявява свойства да адсорбира отрицателно заредени нуклеинови киселини при условия на ниско pH, високо съдържание на сол, докато се елуира с разтвори с високо pH и ниско съдържание на сол.Въз основа на това явление е възможно да се пречисти нуклеиновата киселина.
Различни форми на материали на базата на силициев диоксид са използвани за екстракция на нуклеинови киселини в микрофлуидиката, като силициеви перли, прахове, микрофибърни филтри и силициеви мембрани [23, 24, 25, 26].В зависимост от свойствата на материала, материалите на базата на силиций могат да се използват в микросхеми по различни начини.Например, силициеви гранули, прахове и търговски нанофилтри могат просто да бъдат поставени в порите или микроканалите на микрофлуидни чипове и да помогнат за извличането на нуклеинови киселини от проби [27, 28, 29].Повърхностно модифицираните силициеви мембрани също могат да се използват за бързо пречистване на ДНК от патогени на ниска цена.Например Wang et al.[30] Чрез комбиниране на реакции на денатуриращо усилване с обмен на верига, медииран от везикули, със силициеви мембрани, покрити с хитозанови олигозахариди, беше въведена многофункционална преносима система, която успешно открива 102–108 единици, образуващи колонии.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., а наличието на вируса беше лесно видимо.Пауъл и др.[31] След това бяха използвани базирани на силиций микрочипове за откриване на вируса на хепатит C (HCV), вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), вируса Zika и човешкия папиломен вирус и автоматично размножаване, в което беше разработен 1,3 μl извит микрореактор за улавяне на РНК вируси.и извършете in situ усилване.В допълнение към тези методи, повърхностно модифицираните силициеви микроколони също играят ключова роля в екстракцията на нуклеинова киселина, тъй като геометрията и свойствата на модифициращия материал значително повишават ефективността на екстракцията.Чен и др.[32] предлага микрофлуидна платформа за изолиране на РНК с ниска концентрация на базата на силициеви микроколони с амино покритие.Това микрофлуидно устройство интегрира масив от 0,25 cm2 микропилари върху силиконов субстрат за постигане на по-висока ефективност на екстракция чрез конструкция с високо съотношение повърхностна площ към обем.Предимството на този дизайн е, че микрофлуидното устройство може да постигне до 95% ефективност на екстракция на нуклеинова киселина.Тези базирани на силиций стратегии демонстрират стойността на бързото изолиране на нуклеинови киселини на ниска цена.В комбинация с микрофлуидни чипове, базираните на силиций стратегии за екстракция могат не само да повишат ефективността на откриване на нуклеинова киселина, но също така да улеснят миниатюризацията и интегрирането на аналитичните устройства [20].
Методите за магнитно разделяне използват магнитни частици за изолиране на нуклеинови киселини в присъствието на външно магнитно поле.Често използваните магнитни частици включват Fe3O4 или γ-Fe2O3 магнитни частици, покрити със силициев диоксид, амино и карбоксил [33,34,35,36].Отличителната черта на магнитните частици в сравнение с базираните на силиций SPE методи е лекотата на манипулиране и контрол с външни магнити.
Използвайки електростатичното взаимодействие между нуклеинови киселини и силициев диоксид, при условия на високо съдържание на сол и ниско pH, нуклеиновите киселини се адсорбират върху повърхността на покрити със силициев диоксид магнитни частици, докато при условия на ниско съдържание на сол и високо pH, молекулите могат да бъдат измити отново..Покритите със силициев диоксид магнитни перли правят възможно извличането на ДНК от проби с голям обем (400 μL) с помощта на магнитно контролирано движение [37].Като демонстрация, Rodriguez-Mateos et al.[38] използва регулируеми магнити, за да контролира трансфера на магнитни перли към различни камери.Въз основа на магнитни частици, покрити със силициев диоксид, 470 копия/mL геномна РНК на SARS-CoV-2 могат да бъдат извлечени от проби от отпадъчни води за LAMP откриване на обратна транскрипция (RT-LAMP) и отговорът може да бъде прочетен в рамките на 1 час.невъоръжено око (фиг. 2а).
Устройства на базата на магнитни и порести материали.Концептуална диаграма на микрофлуидното устройство IFAST RT-LAMP за откриване на РНК на SARS-CoV-2 (адаптирано от [38]).b Центробежно микро устройство за dSPE на нуклеинова киселина от букален тампон (адаптирано от [39]).c Вграден самозахранващ се концентратор на проби с помощта на FTA® карта (адаптирано от [50]).d Филтърна хартия Fusion 5, модифицирана с хитозан (адаптирано от [51]).SARS-CoV-2 тежък остър респираторен синдром коронавирус 2, изотермична амплификация, медиирана от обратна транскрипционна верига RT-LAMP, технологични партньори на FTA finders, NA нуклеинова киселина
Положително заредените магнитни частици са идеални за свързване на фосфатния скелет на нуклеинова киселина.При определена концентрация на сол, отрицателно заредените фосфатни групи на нуклеиновите киселини могат да бъдат положително заредени на повърхността на магнитните композитни частици.Затова са разработени магнитни наночастици с грапава повърхност и висока плътност на аминогрупи за извличане на нуклеинови киселини.След магнитно разделяне и блокиране, магнитните наночастици и ДНК комплекси могат да бъдат директно използвани в PCR, което елиминира необходимостта от сложни и отнемащи време операции на пречистване и елуиране [35].Магнитни наночастици, покрити с отрицателни карбоксилни групи, също са използвани за отделяне на нуклеинови киселини, адсорбирани върху повърхности във висока концентрация на полиетиленгликол и разтвори на натриев хлорид [36].С тези повърхностно модифицирани магнитни перли извличането на ДНК е съвместимо с последващо усилване.Dignan и др.[39] описват автоматизирана и преносима центробежна микрофлуидна платформа за предварителна обработка на нуклеинови киселини, което позволява на нетехнически персонал да я използва на място.В допълнение, съвместимостта на изолираната ДНК с LAMP, метод, който е много подходящ за анализ на нуклеинова киселина на място, допълнително демонстрира минимални изисквания за оборудване и пригодност за колориметрични анализи (фиг. 2b).
Методите с магнитни перли предлагат възможност за автоматизирана екстракция, някои от които съществуват в търговски автоматизирани екстрактори на нуклеинова киселина [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, САЩ), QIAcube® HT;CapitalBio (Пекин, Китай) и Biomek®;Бекман (Маями, САЩ).), Флорида, САЩ)].Предимствата на комбинирането на магнитни перли с микрофлуиди могат да се използват за ефективна автоматизирана екстракция на нуклеинови киселини, което потенциално би могло да ускори развитието на молекулярната диагностика;въпреки това, комбинацията от магнитни перли с микрофлуиди все още разчита в голяма степен на сложни системи за контрол за прецизно манипулиране на магнитни перли, което обяснява популярността на търговските продукти, които са обемисти и скъпи, което ограничава по-нататъшното приложение на магнитни перли в POCT.
Няколко порьозни материала като модифицирани нитроцелулозни филтри, карти на Finders Technology Associates (FTA), филтърни хартии на базата на полиетерсулфон и материали с гликаново покритие също са използвани за откриване на нуклеинова киселина [40, 41, 42, 43, 44].Порести влакнести материали като влакнеста хартия за първи път са използвани за изолиране на ДНК чрез физическо заплитане на дълговерижни ДНК молекули с влакна.Малките пори водят до силно физическо ограничаване на ДНК молекулите, което влияе положително върху извличането на ДНК.Поради различните размери на порите на влакнестата хартия, ефективността на екстракцията не може да отговори на нуждите от амплификация на ДНК [45, 46].FTA картата е търговска филтърна хартия, използвана в областта на съдебната медицина и широко използвана в други области на молекулярната диагностика.Чрез използването на целулозна филтърна хартия, импрегнирана с различни химикали за лизиране на клетъчните мембрани в пробата, освободената ДНК е защитена от разграждане до 2 години.Съвсем наскоро беше разработена импрегнирана целулозна хартия за молекулярно откриване на различни патогени, включително SARS-CoV-2, лайшманиоза и малария [47,48,49].ХИВ в изолираната плазма се лизира директно и вирусната нуклеинова киселина се обогатява в мембраната FTA® flow, вградена в концентратора, което позволява ефективно производство на нуклеиновата киселина [50] (фиг. 2c).Основният проблем при откриването на нуклеинова киселина с помощта на FTA карти е, че химикали като гуанидин и изопропанол инхибират последващите реакции на амплификация.За да разрешим този проблем, ние разработихме филтърна хартия, модифицирана с хитозан, Fusion 5, която съчетава предимствата както на физическото преплитане на ДНК молекули и влакнеста филтърна хартия, така и на електростатичната адсорбция на ДНК върху модифицирани с хитозан съединения за постигане на високоефективна екстракция на нуклеинова киселина ..филтърни влакна [51] (фиг. 2d).По подобен начин, Zhu et al.[52] демонстрира модифициран с хитозан PCR метод, базиран на in situ капилярна микрофлуидна система за бързо изолиране и откриване на РНК на вируса Zika.Нуклеиновите киселини могат да бъдат адсорбирани/десорбирани в смесен лизат/PCR среда, съответно, въз основа на свойството за включване/изключване на хитозана.включване и изключване”, отговарящи на pH.
Както бе споменато по-горе, тези стратегии съчетават предимствата на различни твърдофазни материали и повишават ефективността на екстракцията на нуклеинова киселина в микрофлуидите.При практически приложения използването на тези материали в големи количества е неикономично и правилното повърхностно третиране или повърхностна модификация на обикновени материали с тези материали също може да запази тяхната функция.Поради това се смята, че прилагането на тези стратегии след пилотно проучване може да намали разходите.
Тестването на нуклеинова киселина върху микрофлуидни платформи често използва малки обеми на пробата (< 100 µl), следователно изисква амплификация на целевите нуклеинови киселини със специфични сонди за преобразуване в сигнал, който е удобен за откриване надолу по веригата (оптично, електрическо и магнитно) [53, 54]. Тестването на нуклеинова киселина върху микрофлуидни платформи често използва малки обеми на пробата (< 100 µl), следователно изисква амплификация на целевите нуклеинови киселини със специфични сонди за преобразуване в сигнал, който е удобен за откриване надолу по веригата (оптично, електрическо и магнитно) [53, 54]. При тестване на нуклеинови киселини на микрожидкостни платформи често се използват неголеми обеми на проби (< 100 mcl), поради което е необходима амплификация на целеви нуклеинови киселини с помощта на специални зондове за преобразуване в сигнала, удобен за последващо откриване (оптично, електрическо и магнитно) [53, 54]. Когато се тестват нуклеинови киселини върху микрофлуидни платформи, често се използват малки обеми на пробата (<100 µL), така че е необходимо усилване на целевите нуклеинови киселини със специални сонди, за да се преобразува в сигнал, удобен за последващо откриване (оптично, електрическо и магнитно) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 扩增 核酸 核酸 以 转换 为 便于 下游 下游 检测 （光学 、 和 磁学） 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 扩增 目标 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обучението на нуклеиновата киселина на микрожидкостните платформи обикновено използва неголеми обеми образци (<100 mcl), което изисква усилване на целевата нуклеинова киселина с помощта на специални зондове за преобразуване в сигнали за последващо откриване (оптично, електрическо и магнитно) [53, 54]]. Откриването на нуклеинови киселини на микрофлуидни платформи обикновено използва малки обеми на пробата (<100 μl), което изисква амплификация на целевите нуклеинови киселини със специални сонди, за да ги преобразува в сигнали за последващо откриване (оптични, електрически и магнитни) [53, 54]] .Амплификацията на нуклеинова киселина в микрофлуидиката може също да ускори реакциите, да оптимизира границите на откриване, да намали изискванията за проби и да подобри точността на откриване [55, 56].През последните години, с реализирането на бързо и точно откриване, различни методи за амплификация на нуклеинова киселина бяха приложени в микрофлуидиката, включително PCR и някои изотермични реакции на амплификация.Този раздел ще обобщи методите за откриване на нуклеинова киселина, базирани на микрофлуидни системи.
PCR е симулация на процеса на репликация на ДНК на организъм, чиято теория е описана подробно другаде и няма да бъде обсъждана тук.PCR може да амплифицира много малко количество целева ДНК/РНК с експоненциална скорост, което прави PCR мощен инструмент за бързо откриване на нуклеинови киселини.През последните десетилетия са разработени много преносими микрофлуидни устройства, оборудвани с PCR термични циклични системи, за да отговорят на нуждите от диагностика на място [57, 58].PCR върху чип може да бъде разделен на четири типа (конвенционален, с непрекъснат поток, с пространствено превключване и конвективен PCR) според различните методи за контрол на температурата [59].Например, Gee et al.[60] разработиха метод за количествена PCR с директна обратна транскрипция (RT-qPCR) на тяхна собствена микрофлуидна платформа за мултиплексно откриване на SARS-CoV-2, грипни вируси A и B в проби от тампон от гърлото (фиг. 3a).Парк и др.[61] създадоха прост чип за анализ на патогени чрез интегриране на PCR с тънък слой, електроди и управляван с пръст микрофлуиден модул на базата на полидиметилсилоксан.И двете произведения обаче въплъщават общите недостатъци на конвенционалната PCR.PCR изисква термичен цикъл, което ограничава по-нататъшната миниатюризация на устройството и намалява времето за тестване.
Разработването на базирана на непрекъснат поток микрофлуидна и пространствено превключвана PCR е от решаващо значение за справяне с този проблем.Използвайки дълъг змиевиден канал или къс прав канал, PCR с непрекъснат поток може да осигури бързо усилване чрез активно циркулиране на реагенти в три зони за предварително нагряване с помпа извън чипа.Тази операция успешно избягва преходната фаза между различни реакционни температури и по този начин значително намалява времето за тестване [62] (фиг. 3b).В друго изследване на Jung et al.[63] предложи нов ротационен PCR генетичен анализатор, който съчетава характеристиките на фиксирана и поточна PCR за ултрабърза и мултиплексна PCR с обратна транскрипция (фиг. 3c).За амплификация на нуклеинова киселина, PCR микрочипът ще се върти през три нагряващи блока при различни температури: 1. Блок за денатурация 94°C, 2. Блок за отгряване при 58°C, 3. Блок за разширяване при 72°C.
Приложение на PCR в микрофлуидиката.Схематично представяне на dirRT-qPCR върху микрофлуидна платформа (адаптирано от [60]).b Схематично представяне на PCR микрочип с непрекъснат поток, базиран на змиевиден канал (адаптиран от [62]).c Схематично представяне на ротационен PCR генетичен анализатор, състоящ се от микрочип, три нагревателни блока и стъпков двигател (адаптиран от [63]).d Диаграма на термоконвективна PCR с центрофугиране и настройка (адаптирано от [64]).DirRT-qPCR, директна количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция
Използвайки капиляри и бримки или дори тънки плаки, конвекционният PCR може бързо да амплифицира нуклеинови киселини чрез естествена свободна топлинна конвекция без необходимост от външна помпа.Например, микрофлуидна платформа от цикличен олефинов полимер е разработена върху изработен въртящ се етап на нагряване, който използва термичен цикъл с центрофугиране в PCR микроканал [64] (фиг. 3d).Реакционният разтвор се задвижва от термична конвекция, която непрекъснато обменя висока и ниска температура в микроканал с пръстеновидна структура.Целият процес на усилване може да бъде завършен за 10 минути с граница на откриване от 70,5 pg/канал.
Както се очакваше, бързият PCR е мощен инструмент за напълно интегрирани системи за молекулярна диагностика и мултиплексен анализ на отговор на проба.Бързата PCR значително намалява времето, необходимо за откриване на SARS-CoV-2, което допринася за ефективния контрол на пандемията от COVID-19.
PCR изисква сложен термичен цикъл, който не е подходящ за POCT.Съвсем наскоро техниките за изотермична амплификация са приложени към микрофлуидиката, включително, но не само LAMP, рекомбиназна полимеразна амплификация (RPA) и амплификация на базата на последователности на нуклеинова киселина [65,66,67,68].С тези техники нуклеиновите киселини се усилват при постоянна температура, улеснявайки създаването на евтини, високочувствителни преносими POCT устройства за молекулярна диагностика.
Базираните на LAMP микрофлуидични анализи с висока производителност позволяват многократно откриване на инфекциозни заболявания [42, 69, 70, 71].В комбинация с центробежна микрофлуидна система, LAMP може допълнително да улесни автоматизирането на откриването на нуклеинова киселина [69, 72, 73, 74, 75].SlipChip със завъртане и реагиране е разработен за визуално откриване на множество паралелни бактерии с помощта на LAMP [76] (фиг. 4а).Когато се използва оптимизиран LAMP в анализа, съотношението флуоресцентен сигнал към шум е приблизително 5 пъти, а границата на откриване достига 7,2 копия/μl геномна ДНК. Освен това съществуването на пет общи храносмилателни бактериални патогени, включително Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, бяха визуализирани въз основа на метода за <60 минути. Освен това съществуването на пет общи храносмилателни бактериални патогени, включително Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, бяха визуализирани въз основа на метода за <60 минути.Освен това, наличието на пет често срещани бактериални патогени на храносмилателния тракт, включително Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, беше визуализирано с помощта на този метод за по-малко от 60 минути.此外，基于该方法在<60分钟内可视化了五种常见消化道细菌病原体的存在，包括蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、肠沙门氏菌、河流弧菌和副溶血性弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血性。。。 弧菌 弧菌 弧菌ХИПВ допълнение, присъствието на пет общи бактериални стомашно-чревни патогени, включително Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius и Vibrio parahaemolyticus, беше визуализирано с помощта на този метод за по-малко от 60 минути.
Предимствата на LAMP в микрофлуидиката включват, наред с други, бърза реакция и миниатюрно откриване.Въпреки това, поради температурата на реакцията (около 70°C), по време на LAMP неизбежно се генерират аерозоли, което води до висок процент на фалшиви положителни резултати.Специфичността на анализа, дизайнът на праймера и контролът на температурата също трябва да бъдат оптимизирани за LAMP.В допълнение, дизайните на чипове, които прилагат откриване на множество цели на един чип, са от голяма стойност и трябва да бъдат разработени.В допълнение, LAMP е подходящ за многофункционално откриване, интегрирано в един чип, което е от голямо значение, но все още има много място за развитие.
Високият фалшив положителен процент на LAMP може да бъде частично намален с RPA, тъй като относително ниската реакционна температура (~37 °C) води до относително малко проблеми с изпаряването [77].В системата RPA два противоположни праймера инициират синтеза на ДНК чрез свързване с рекомбиназа и амплификацията може да бъде завършена в рамките на 10 минути [78,79,80,81].Следователно целият RPA процес е много по-бърз от PCR или LAMP.През последните години беше доказано, че микрофлуидната технология допълнително подобрява скоростта и точността на RPA [82,83,84].Например, Liu et al.[85] разработиха микрофлуиден интегриран тест за амплификация на полимераза рекомбиназа в страничен поток за бързо и чувствително откриване на SARS-CoV-2 чрез интегриране на обратна транскрипция RPA (RT-RPA) и универсална система за откриване на тестови ленти в страничен поток.в една микрофлуидна система.Фигура 4b).Лимитът на откриване е 1 копие/µl или 30 копия/проба и откриването може да бъде завършено за около 30 минути.Kong и др.са разработили носимо микрофлуидно устройство.[86] използва телесна температура и базирана на мобилен телефон система за флуоресцентно откриване за бързо и директно откриване на HIV-1 ДНК с помощта на RPA (Фигура 4в).Носещият се RPA анализ открива 100 копия/mL от целевата последователност в рамките на 24 минути, демонстрирайки голям потенциал за бърза диагностика на заразени с ХИВ-1 бебета в условия с ограничени ресурси.
Изотермично усилване при тестване на място (POCT).Разработка и производство на спин и реакция SlipChip.След плазмено заваряване, горният и долният чипове бяха сглобени с набор от гайки, за да се образува крайният чип (адаптирано от [76]).b Схема на системата MI-IF-RPA за откриване на COVID-19 (адаптирано от [85]).c Схема на носим RPA тест за бързо откриване на HIV-1 ДНК (адаптиран от [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM карбоксифлуоресцеин, човешки имунодефицитен вирус HIV, RPA рекомбиназна полимеразна амплификация, LED светлоизлъчващ диод, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polymerase Усилване
Базираната на микрофлуиди RPA се развива бързо, но разходите за производство на чипове и консумацията на реакция са твърде високи и трябва да бъдат намалени, за да се увеличи наличността на тази технология.В допълнение, високата чувствителност на RPA може да повлияе на усилването на неспецифични продукти, особено при наличие на замърсяване.Тези ограничения могат да повлияят на приложението на RPA в микрофлуидни системи и да заслужават допълнително оптимизиране.Необходими са също така добре проектирани праймери и сонди за различни цели, за да се подобри осъществимостта на базираните на RPA микрофлуидни стратегии в POCT.
Cas13 и Cas12a имат способността да разцепват произволно нуклеинови киселини и по този начин могат да бъдат разработени като инструменти за откриване и диагностика.Cas13 и Cas12a се активират при свързване съответно с таргетната ДНК или РНК.Веднъж активиран, протеинът започва да разцепва други близки нуклеинови киселини, след което насочващите РНК, насочени към патоген-специфични нуклеинови киселини, могат да разцепват потушени флуоресцентни сонди и да освободят флуоресценция.Въз основа на тази теория Kellner et al.[87] разработиха метод, базиран на Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], и Broughton et al.[88] разработиха друг подход, базиран на Cas12a [CRISPR Trans Reporter, насочен към ДНК ендонуклеаза (DTECR)].
През последните години се появиха различни методи за откриване на нуклеинови киселини, базирани на CRISPR [89, 90].Конвенционалните методи, базирани на CRISPR, често отнемат време и са трудоемки поради множество процедури, включително екстракция на нуклеинова киселина, амплификация и откриване на CRISPR.Излагането на течности на въздух може да увеличи вероятността от фалшиви положителни резултати.Като се има предвид горното, системите, базирани на CRISPR, имат остра нужда от оптимизация.
Пневматично контролирана микрофлуидна платформа, която може да извършва 24 анализа паралелно, е разработена за приложения за откриване на CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a [91].Системата е оборудвана с устройство за откриване на флуоресценция, което заобикаля амплификацията на нуклеинова киселина и автоматично открива фемтомоларни ДНК и РНК проби.Чен и др.[92] интегрирана рекомбиназна амплификация със системата CRISPR-Cas12a в центробежни микрофлуиди (фиг. 5а).Тази работа преодолява трудността при интегрирането на тези два процеса, тъй като Cas12a може да усвоява пратеник ДНК и да инхибира процеса на амплификация.В допълнение, Chen et al.[92] допълнително съхранява реакционните реагенти в центробежен микрофлуиден контрол, за да завърши автоматично целия процес.В друга работа Silva et al.[93] разработиха диагностичен метод без усилване на CRISPR/Cas12a и смартфон за откриване на SARS-CoV-2 (фиг. 5b).Този анализ, известен като базирана на мобилен телефон система без амплификация, включва CRISPR/Cas-зависим ензим, който се основава на визуализация на смартфон на генерирани от каталаза балонни сигнали в микрофлуидни канали.Чувствително откриване на по-малко от 50 копия/µl нуклеинова киселина без предварително усилване, целият процес от инжектирането на пробата до отчитането на сигнала отнема само 71 минути.
Методи за откриване на нуклеинова киселина, базирани на CRISPR.Центробежна POCT за интегрирана молекулярна диагностика, базирана на CRISPR (адаптирано от [92]).b Разработване на теста CASCADE за базиран на смартфон анализ на SARS-CoV-2 (адаптиран от [93]).RAA рекомбиназна амплификация, PAM съседен протоспейсър мотив, CRISPR клъстерирани къси палиндромни повторения на редовни интервали, CASCADE система без клетъчна амплификация с CRISPR/CAS-зависими ензими, 1-етил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид хидрохлорид EDC
Като последна стъпка в откриването на нуклеинова киселина, откриването на сигнала отразява директно диагностичните резултати и е критичен фактор в разработването на ефективна, чувствителна и точна POCT.Сигналите могат да се четат с помощта на различни методи като флуоресцентни, електрохимични, колориметрични и магнитни стратегии.В този раздел ние описваме обосновката за всеки подход и сравняваме молекулярната диагностика на инфекциозни заболявания в микрофлуидиката.
Базираните на флуоресценция стратегии се използват широко за POCT диагностика на инфекциозни заболявания поради техните забележителни предимства на отлична чувствителност, ниска цена, лекота на работа и анализ на място [94, 95].Тези стратегии използват белязани флуорофори като флуоресцентни багрила и наноматериали за създаване на откриваем сигнал (усилване или потушаване на флуоресценцията).Това откритие предполага, че стратегиите, базирани на флуоресценция, могат да бъдат разделени на директно флуоресцентно маркиране, флуоресцентно откриване на сигнал и изключване на сигнала [96].Директното откриване на флуоресцентни етикети използва специални флуоресцентни етикети за маркиране на специфични лиганди, които генерират определено количество флуоресценция, когато са селективно свързани с мишена.За флуоресцентно откриване на базата на сигнала, качеството на флуоресцентния сигнал е положително свързано с магнитуда, който представлява интерес.Интензитетът на флуоресценция е незначителен в отсъствието на мишена и се открива, когато има достатъчно количество мишена.Обратно, интензитетът на флуоресценцията, открит от флуоресценцията на „изключен сигнал“, е обратно пропорционален на количеството на целта, като първоначално достига максимална стойност и постепенно намалява с увеличаването на целта.Например, използвайки CRISPR-Cas13a зависимия от целта транс-разцепващ механизъм, Tian et al.[97] разработиха нова стратегия за разпознаване за откриване на РНК, които заобикалят обратната транскрипция директно (фиг. 6а).При свързване с комплементарни целеви РНК, комплексът CRISPR-Cas13-РНК може да се активира, задействайки трансколатерално разцепване от неспецифични репортерни РНК.Флуоресцентно белязаният репортер [флуорофор (F)] се гаси от гасителя (Q) непокътнат и флуоресцира, когато се разцепи от активирания комплекс.
Предимството на електрохимичното откриване е висока скорост на откриване, лесно производство, ниска цена, лесен за носене и автоматичен контрол.Това е мощен аналитичен метод за POCT приложения.Въз основа на полеви транзистори с графен Gao et al.[98] разработиха нанобиосензор за мултиплексно откриване на антигени на Лаймска болест от бактерии Borrelia burgdorferi с граница на откриване от 2 pg/mL (фиг. 6b).
Колориметричните анализи са използвани в POCT приложения, като се възползват от предимствата на преносимост, ниска цена, лекота на подготовка и визуално четене.Колориметричното откриване може да използва окислението на пероксидаза или подобни на пероксидаза наноматериали, агрегацията на наноматериали и добавянето на индикаторни багрила за преобразуване на информацията за наличието на целеви нуклеинови киселини във видими промени в цвета [99, 100, 101].По-специално, златните наночастици се използват широко в разработването на колориметрични стратегии и поради способността им да предизвикват бързи и значителни промени в цвета, има нарастващ интерес към разработването на POCT колориметрични платформи за in situ диагностика на инфекциозни заболявания [102].С интегрирано центробежно микрофлуидно устройство [103], хранителните патогени в замърсените млечни проби могат да бъдат автоматично открити на ниво 10 бактериални клетки и резултатите могат да бъдат прочетени визуално в рамките на 65 минути (фиг. 6c).
Техниките за магнитно отчитане могат точно да открият аналитите с помощта на магнитни материали и през последните десетилетия има значителен интерес към приложенията на POCT.Техниките за магнитно отчитане имат някои уникални предимства като евтини магнитни материали, а не скъпи оптични компоненти.Въпреки това, използването на магнитно поле подобрява ефективността на откриване и намалява времето за подготовка на пробата [104].В допълнение, резултатите от магнитното сондиране демонстрират висока специфичност, чувствителност и високо съотношение сигнал/шум поради незначителния магнитен фонов сигнал на биологични проби [105].Шарма и др.интегрира базиран на магнитен тунел биосензор в преносима микрочипова платформа.[106] за мултиплексно откриване на патогени (фиг. 6d).Биосензорите чувствително откриват субнаномоларни нуклеинови киселини, изолирани от патогени.
Типичен метод за откриване на сигнал.Концепцията за хиперлокализирано откриване на Cas13a (адаптирана от [97]).b Графенов нанобиосензор FET в комбинация с Lyme GroES scFv (адаптиран от [98]).c Колориметрични индикации за мултиплексно откриване на хранителни патогени в центробежен микрофлуиден чип: проби № 1 и № 3 с целеви патогени и проби № 2, № 4 и № 5 без целеви патогени (адаптирано от [103]) .d Биосензор, базиран на магнитно тунелно съединение, включително платформа, вграден блокиращ усилвател, контролен блок и захранване за генериране/получаване на сигнал (адаптирано от [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS диметикон, PMMA полиметилметакрилат
Въпреки отличните характеристики на горните методи за откриване, те все още имат недостатъци.Тези методи се сравняват (таблица 1), включително някои приложения с подробности (за и против).
С развитието на микрофлуидиката, микроелектромеханичните системи, нанотехнологиите и науката за материалите, използването на микрофлуидни чипове за откриване на инфекциозни заболявания непрекъснато напредва [55,96,107,108].Прецизното манипулиране на миниатюрно оборудване и течности допринася за диагностичната точност и рентабилност.Следователно за по-нататъшно развитие са положени усилия за оптимизиране и надграждане на чиповете, което води до различни микрофлуидни чипове с различни структури и функции.Тук представяме накратко няколко често срещани типа микрофлуидни платформи и сравняваме техните характеристики (плюсове и минуси).Освен това повечето от изброените по-долу примери се фокусират основно върху борбата със SARS-CoV-2.
LOCC са най-разпространените миниатюризирани сложни аналитични системи и техните операции са силно миниатюризирани, интегрирани, автоматизирани и паралелизирани от инжектиране и подготовка на пробата, контрол на потока и откриване на течност [109, 110].Течностите се манипулират чрез внимателно проектирана геометрия и взаимодействието на много физически ефекти като градиенти на налягането, капилярно действие, електродинамика, магнитни полета и акустични вълни [111].LOCC показва отлични предимства при скрининг с висока пропускателна способност и многократно откриване, с бърза скорост на анализ, малък размер на извадката, ниска консумация на енергия и висока ефективност на управление и работа;въпреки това устройствата LOCC са много деликатни, както и производството, опаковането и взаимодействието.Мултиплексирането и повторната употреба обаче са изправени пред огромни трудности [96].В сравнение с други платформи, LOCC има уникални предимства по отношение на максимално разнообразие от приложения и най-добра технологична съвместимост, но недостатъците му също са очевидни, а именно висока сложност и лоша повторяемост.Зависимостта от външни помпи, които често са обемисти и скъпи, допълнително ограничава използването им при POCT.
По време на избухването на COVID-19 LOCC получи много внимание.В същото време има няколко нови чипа, които съчетават няколко технологии.Например смартфоните сега се използват широко като преносими устройства за анализ и имат голям потенциал за интегриране на LOCC.Сън и др.[21] изработи микрофлуиден чип, който позволява мултиплексиране на специфични последователности от нуклеинови киселини на пет патогена, включително SARS-CoV-2, с помощта на LAMP и ги анализира с помощта на смартфон в рамките на 1 час след края на реакцията.Като друг пример, Sundah et al.[112] създаде молекулярен превключвател [каталитично усилване чрез превключвател на молекулярно преходно състояние (CATCH)] за директно и чувствително откриване на SARS-CoV-2 РНК цели с помощта на смартфони. CATCH е съвместим с преносим LOCC и постига превъзходна производителност (приблизително 8 РНК копия/μl; < 1 час при стайна температура) [112]. CATCH е съвместим с преносим LOCC и постига превъзходна производителност (приблизително 8 РНК копия/μl; < 1 час при стайна температура) [112]. CATCH е съвместим с портативен LOCC и осигурява превъзходна производителност (примерно 8 копия РНК/мкл; < 1 час при стайна температура) [112]. CATCH е съвместим с преносим LOCC и осигурява отлична производителност (приблизително 8 РНК копия/µl; < 1 час при стайна температура) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH е съвместим с портативни LOCC и притежава изключителна производителност (примерно 8 копия РНК/мкл; < 1 час при стайна температура) [112]. CATCH е съвместим с преносими LOCC и има отлична производителност (приблизително 8 РНК копия/µl; < 1 час при стайна температура) [112].Освен това устройствата LOCC за молекулярна диагностика също използват някои движещи сили като вакуум, разтягане и електрически полета.Kang и др.[113] демонстрира ултра-бърза PCR наноплазма върху чип в реално време за бърза и количествена диагностика на COVID-19 на полето, използвайки вакуумен плазмоничен течен PCR чип.Li et al.[114] впоследствие разработи микрофлуиден чип, управляван от разтягане, който позволи диагностицирането на COVID-19.Платформата използва системата за усилване RT-LAMP, за да определи дали дадена проба е качествено положителна или отрицателна.Впоследствие Ramachandran et al.[115] постигна подходящи градиенти на електрическо поле, използвайки изотахофореза (ITP), селективна техника за фокусиране на йони, прилагана в микрофлуидиката.С ITP целевата РНК от сурови проби от назофарингеален тампон може да бъде автоматично пречистена.След това Ramachandran et al.[115] Комбинирането на това ITP пречистване с ITP-усилени LAMP и CRISPR анализи открива SARS-CoV-2 в човешки назофарингеален тампон и клинични проби за около 35 минути.Освен това непрекъснато се появяват нови идеи.Джадхав и др.[116] предложиха диагностична схема, базирана на повърхностно подобрена Раманова спектроскопия в комбинация с микрофлуидно устройство, съдържащо или вертикално ориентирани покрити със злато/сребро въглеродни нанотръби или електронапредени микро/нанотръби за еднократна употреба.Функционализираните с мембрана вградени филтърни микроканали са за еднократна употреба.Устройството адсорбира вируси от различни телесни течности/ексудации като слюнка, назофаринкс и сълзи.По този начин титърът на вируса е изобилен и вирусът може да бъде точно идентифициран чрез сигнатурата на Raman.
LOAD е центробежна микрофлуидна платформа, в която всички процеси се контролират от честотен протокол, който върти микроструктуриран субстрат [110].Устройството LOAD се характеризира с използване на центробежна сила като важна движеща сила.Течностите също са обект на капилярни сили, сили на Ойлер и Кориолис.Използвайки устройство за центрофуга, анализите се извършват при непрекъсната работа с течност от радиална навътре към външна позиция, елиминирайки необходимостта от допълнителни външни тръби, помпи, задвижващи механизми и активни клапани.Накратко, един единствен метод на управление опростява работата.Силите, действащи върху течността в същия микрофлуиден канал на същото разстояние от центъра на натоварване, са равни, което прави възможно повторението на структурата на канала.По този начин оборудването LOAD е по-просто и по-икономично за проектиране и производство от конвенционалното оборудване LOCC, докато реакциите са до голяма степен независими и паралелни;въпреки това, поради високата механична якост на центробежното оборудване, наличният материал за чипове е ограничен и малките обеми са трудни.към колата.В същото време повечето LOAD устройства са проектирани само за еднократна употреба, което е скъпо за широкомащабно откриване [96, 117, 118, 119].
През последните десетилетия LOAD, считан за едно от най-обещаващите микрофлуидни устройства, получи значително внимание от изследователи и производители.По този начин LOAD получи широко признание и се използва за молекулярна диагностика на инфекциозни патогени [120, 121, 122, 123, 124], особено по време на избухването на COVID-19.Например в края на 2020 г. Ji et al.[60] демонстрира директен RT-qPCR анализ за бързо и автоматизирано паралелно откриване на SARS-CoV-2 и инфекции от грип A и B в проби от тампон от гърлото.Тогава Xiong et al.[74] представи интегрирана в LAMP дискоидна микрофлуидна платформа за бързо, точно и едновременно откриване на седем човешки респираторни коронавируса, включително SARS-CoV-2, в рамките на 40 минути.В началото на 2021 г. de Oliveira et al.[73] демонстрира полистирен тонер центробежен микрофлуиден чип, управляван ръчно с ротатор с върха на пръста, за RT-LAMP молекулярна диагностика на COVID-19.Впоследствие Dignan et al.[39] представиха автоматизирано преносимо центрофужно микроустройство за пречистване на РНК на SARS-CoV-2 директно от срезове от букален тампон.Медвед и др.[53] предложи вградена система за вземане на проби от аерозол SARS-CoV-2 с въртящ се микрофлуиден флуоресцентен чип с малък обем с граница на откриване от 10 копия/μL и минимален праг на цикъл от 15 минути.Суарес и др.[75] наскоро съобщиха за разработването на интегрирана модулна центробежна микрофлуидна платформа за директно откриване на РНК на SARS-CoV-2 в топлинно инактивирани проби от назофарингеален тампон, използвайки LAMP.Тези примери демонстрират големите предимства и обещанието на LOAD в молекулярната диагностика на COVID-19.
През 1945 г. Muller и Clegg [125] за първи път представят микрофлуидни канали на хартия, използвайки филтърна хартия и парафин.През 2007 г. групата Whitesides [126] създаде първата функционална хартиена платформа за тестване на протеини и глюкоза.Хартията се превърна в идеален субстрат за микрофлуиди.Хартията има присъщи свойства като хидрофилност и пореста структура, отлична биосъвместимост, леко тегло, гъвкавост, сгъваемост, ниска цена, лекота на използване и удобство.Класическите µPAD се състоят от хидрофилни/хидрофобни структури, изградени върху хартиени субстрати.В зависимост от триизмерната структура, μPAD могат да бъдат разделени на двуизмерни (2D) и триизмерни (3D) μPAD.2D µPADs се произвеждат чрез формиране на хидрофобни граници за образуване на микрофлуидни канали, докато 3D µPADs обикновено се правят от купчини слоеве от 2D микрофлуидна хартия, понякога чрез сгъване на хартия, техники на приплъзване, отворени канали и 3D печат [96].Водни или биологични течности на μPAD се контролират основно от капилярна сила без външен източник на захранване, което улеснява предварителното съхранение на реагентите, манипулирането на пробите и мултиплексното откриване.Прецизният контрол на потока и мултиплексното откриване обаче са възпрепятствани от недостатъчна скорост на откриване, чувствителност и повторна употреба [96, 127, 128, 129, 130].
Като необичайна микрофлуидна платформа, μPAD е широко популяризиран и разработен за молекулярна диагностика на инфекциозни заболявания като HCV, HIV и SARS-CoV-2 [131, 132].За селективно и чувствително откриване на HCV, Tengam et al.[133] разработиха нов биосензор, базиран на флуоресцентна хартия, използвайки силно специфична проба за нуклеинова киселина, базирана на пиролидинил пептид.Нуклеиновите киселини са ковалентно имобилизирани върху частично окислена целулозна хартия чрез редуктивно алкилиране между аминогрупи и алдехидни групи и откриването се основава на флуоресценция.Тези сигнали могат да бъдат разчетени от специално изработена джаджа с преносима флуоресцентна камера в комбинация с камера на мобилен телефон.Впоследствие Lu et al.[134] проектираха гъвкав електрод на хартиена основа, базиран на никел/златни наночастици/въглеродни нанотръби/поливинилов алкохол органометални рамкови композити за откриване на ХИВ мишена чрез ДНК хибридизация, използвайки метиленово синьо като ДНК редокс индикатор.Съвсем наскоро Chowdury et al.[135] представиха хипотетичен дизайн на платформа за µPAD тестване на място при използване на сурова слюнка на пациента в комбинация с LAMP и преносима технология за изображения за откриване на аналит на COVID-19.
Тестовете за страничен поток насочват флуидите чрез капилярни сили и контролират движението на флуидите чрез омокряемостта и характеристиките на порести или микроструктурирани субстрати.Устройствата за страничен поток се състоят от проба, конюгат, инкубатор и детекция и абсорбиращи подложки.Молекулите на нуклеиновата киселина в LFA разпознават специфични свързващи вещества, които са предварително съхранени на мястото на свързване и се свързват като комплекси.Докато течността преминава през инкубационните и детекторните плочи, комплексите се улавят от молекулите за улавяне, разположени върху тестовите и контролните линии, показвайки резултати, които могат да бъдат прочетени директно с просто око.Обикновено LFA може да бъде завършен за 2-15 минути, което е по-бързо от традиционното откриване.Благодарение на специалния механизъм, LFA изисква малко операции и не изисква допълнително оборудване, което го прави много лесен за използване.Той е лесен за производство и миниатюризиране, а цената на хартиените субстрати е по-ниска.Въпреки това, той се използва само за качествен анализ и количественото откриване е много трудно, а способността за мултиплексиране и производителността са много ограничени и само една достатъчно нуклеинова киселина може да бъде открита наведнъж [96,110,127].
Въпреки че повечето приложения на LFA са фокусирани върху имуноанализи, използването на LFA за молекулярна диагностика в микрофлуидни чипове също е ефективно и популярно [136].В случай на вирус на хепатит B, HIV и SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] предложи LFA платформа с наночастици с повишена конверсия и демонстрира гъвкавостта на тази миниатюризирана и преносима платформа чрез чувствително и количествено откриване на множество мишени, като HBV нуклеинова киселина.В допълнение, Fu et al.[138] демонстрира нов LFA, базиран на повърхностно подобрена раманова спектроскопия за количествен анализ на HIV-1 ДНК при ниски концентрации.За бързо и чувствително откриване на SARS-CoV-2, Liu et al.[85] разработиха микрофлуидно интегриран RPA анализ на страничния поток чрез комбиниране на RT-RPA и универсална система за откриване на страничен поток в една микрофлуидна система.
Приложението на различни микрофлуидни платформи варира в зависимост от конкретни изследвания, като се възползват напълно от възможностите и предимствата на платформите.С достъпни вентили, помпи и канали, LOCC е най-всеобхватната платформа за разнообразие от приложения и оперативна съвместимост с най-голямо пространство за развитие.Затова се надяваме и препоръчваме най-новите проучвания да бъдат проведени в LOCC като първи опит и условията да бъдат оптимизирани.Освен това се очаква да бъдат открити и използвани в системата по-ефективни и точни методи.LOAD се отличава с прецизен контрол на течности от съществуващи LOCC устройства и демонстрира уникални предимства при единични задвижвания чрез центробежна сила без необходимост от външни задвижвания, докато паралелните реакции могат да бъдат отделни и синхронизирани.Така в бъдеще LOAD ще се превърне в основната микрофлуидна платформа с по-малко ръчни операции и по-зрели и автоматизирани технологии.Платформата µPAD съчетава предимствата на LOCC и материали на хартиена основа за евтина диагностика за еднократна употреба.Следователно бъдещото развитие трябва да се фокусира върху удобни и добре утвърдени технологии.В допълнение, LFA е много подходящ за откриване с невъоръжено око, обещавайки да намали консумацията на проби и да ускори откриването.Подробно сравнение на платформата е показано в таблица 2.
Цифровите анализи разделят пробата на много микрореактори, всеки от които съдържа отделен брой целеви молекули [139, 140].Дигиталните анализи предлагат значителни предимства за извършване на абсолютно количествено определяне чрез извършване на хиляди паралелни биохимични експерименти едновременно и индивидуално в отделения с микронен мащаб, а не в непрекъсната фаза.В сравнение с традиционната микрофлуидика, компартментните реакции могат да намалят обема на пробата, да увеличат ефективността на реакцията и да бъдат лесно интегрирани с други аналитични методи без необходимост от канали, помпи, клапани и компактни конструкции [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Следните два метода се използват в дигиталните анализи за постигане на равномерно и точно разделяне на разтвори, включително реагенти и проби като клетки, нуклеинови киселини и други частици или молекули: (1) капкови емулсии, използващи нестабилността на повърхността на течността;(2) разделянето на масива се извършва от геометричните ограничения на устройството.При първия метод капчици, съдържащи реагенти и проби в микроканали, могат да бъдат създадени чрез пасивни методи като съпътстващ ток, напречен поток, фокусиране на потока, поетапно емулгиране, микроканално емулгиране и мембрани чрез вискозни сили на срязване и емулгиране с промяна на канала.локализация [143, 145, 146, 148, 149] или използване на активни методи [150, 151], които въвеждат допълнителна енергия чрез електрически, магнитен, термичен и механичен контрол.При последния подход най-добрата еднородност на обема на флуида в микрофлуидните камери се споделя чрез запазване на пространствени структури с еднакъв размер, като микровдлъбнатини и повърхностни масиви [152,153,154].По-специално, капчиците са основни участъци на потока, които също могат да бъдат генерирани и манипулирани върху електродни масиви, базирани на цифрова микрофлуидика (DMF).Електрическото намокряне на диелектриците е една от най-добре проучените теории за DMF, тъй като електронамокрянето на диелектриците позволява прецизно манипулиране на отделни капки, контролирайки формата на течността и асиметричните електрически сигнали, преминаващи през различни страни [141, 144].Основните операции с капчици в DMF включват сортиране, разделяне и сливане [151, 155, 156], които могат да се прилагат в различни области на анализа, особено при молекулярно откриване [157, 158, 159].
Дигиталното откриване на нуклеинова киселина е технология за молекулярна диагностика от трето поколение след конвенционална PCR и количествена PCR в реално време (qPCR), успоредно с високопроизводително секвениране и течна биопсия.През последните две десетилетия цифровите нуклеинови киселини се развиха бързо в областта на молекулярната диагностика на инфекциозни патогени [160, 161, 162].Абсолютното количествено определяне на дигиталното откриване на нуклеинова киселина започва с опаковане на проби и реагенти в отделни отделения, за да се гарантира, че всяка целева последователност има същата вероятност да навлезе във всяко отделно отделение.Теоретично на всяка секция могат да бъдат приписани множество целеви последователности или може да няма независима система за микрореакция.Чрез различните сензорни механизми, описани по-горе, отделения с микробни целеви последователности, които генерират сигнали над определен праг, могат да бъдат визуализирани с невъоръжено око или от машина и са етикетирани като положителни, докато други отделения, които генерират сигнали под прага, са етикетирани като положителни .отрицателни, което прави сигнала за всяка секция булев.По този начин, чрез изчисляване на броя на създадените отделения и процента на положителните резултати след реакцията, оригиналните копия на тестовите проби могат да бъдат съпоставени с помощта на формулата на разпределение на Поасон без необходимост от стандартна крива, която се изисква за рутинни количествени анализи като като qPCR.[163] В сравнение с традиционните методи за молекулярна диагностика, дигиталното откриване на нуклеинова киселина има по-висока степен на автоматизация, по-висока скорост и чувствителност на анализа, по-малко реактиви, по-малко замърсяване и по-опростен дизайн и производство.Поради тези причини използването на дигитални анализи, особено базирани на капки методи, за молекулярна диагностика, комбиниращи техники за усилване и разчитане на сигнала, е добре проучено по време на критичното огнище на SARS-CoV-2.Например, Yin et al.[164] комбинирани капкови дигитални и бързи PCR методи за откриване на гените ORF1ab, N и RNase P в SARS-CoV-2 в микрофлуиден чип.Трябва да се отбележи, че системата успя да идентифицира положителен сигнал в рамките на 115 секунди, което е по-бързо от конвенционалната PCR, което показва нейната ефективност при откриване на място (Фигура 7а).Dong и др.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] и Alteri et al.[167] също приложи капкова цифрова PCR (ddPCR) за откриване на SARS-CoV-2 в микрофлуидна система с впечатляващи резултати.За да подобрят допълнително степента на откриване, Shen et al.[168] постигна базирано на ddPCR изобразяване на чип само за 15 секунди без използването на техники за съединяване на изображения, ускорявайки ddPCR технологичния процес от лаборатория до приложение.Прилагат се не само методи за термична амплификация като PCR, но също така се използват методи за изотермична амплификация за опростяване на реакционните условия и бърз отговор.Лу и др.[71] разработи SlipChip за капков анализ, способен да генерира капчици с различни размери при висока плътност в една стъпка и да определя количествено SARS-CoV-2 нуклеиновите киселини с помощта на цифров LAMP (Фигура 7b).Като бързо развиваща се технология, CRISPR може също да играе важна роля в цифровото откриване на нуклеинови киселини чрез удобни колориметрични изображения без необходимост от допълнителни оцветявания с нуклеинови киселини.Акерман и др.разработи комбинаторна матрична реакция за мултиплексна оценка на нуклеинови киселини.[158] откриват 169 вируса, свързани с човека, включително SARS-CoV-2, в капчици, съдържащи реагенти за откриване на нуклеинова киселина на базата на CRISPR-Cas13 в анализ с микроямка (Фигура 7c).В допълнение, изотермичното усилване и технологията CRISPR могат да се използват в една и съща система, за да се комбинират предимствата и на двете.Парк и др.[169] Дигитален анализ CRISPR/Cas12a е разработен в търговски микрофлуиден чип за откриване на екстрахиран и убит от топлина SARS-CoV-2 въз основа на едноетапно RT-RPA с по-кратко и по-високо откриване на сигнала към фона времево съотношение., по-широк динамичен диапазон и по-добра чувствителност (фиг. 7d).Някои описания на тези примери са дадени в таблица 3.
Типична цифрова платформа за откриване на нуклеинова киселина.a Бързият цифров PCR работен процес се състои от четири ключови стъпки: подготовка на пробата, разпределение на реакционната смес, процес на амплификация и количествено определяне на целта (адаптирано от [164]).b Схематично показващ анализ на капчици SlipChip за образуване на капки при висока плътност (адаптирано от [71]).c Диаграма на работния поток на CARMEN-Cas13 (адаптирано от [158]).d Преглед на усъвършенствано цифрово откриване на вируси с CRISPR/Cas в едно гърне (адаптирано от [169]).W/O вода в масло, полидиметилсилоксан PDMS, PCR полимеразна верижна реакция, събиране на данни DAQ, пропорционално интегрално производно на PID, комбинаторна матрична реакция CARMEN за мултиплексна оценка на нуклеинова киселина, SARS-CoV-2, тежък остър респираторен синдром, коронавирус 2, RT Амплификация на обратна транскриптаза рекомбиназа полимераза-RPA, S/B сигнал във фонов режим