Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Методите за етикетиране на ензимна близост, базирани на активирани естери или фенокси радикали, се използват широко за картографиране на субклетъчни протеоми и протеинови интерактори в живи клетки.Въпреки това, активираните естери са по-малко реактивни, което води до широк радиус на маркиране, а фенокси радикалите, генерирани от третиране с пероксид, могат да попречат на редокс пътищата.Тук докладваме метод за фотоактивиране, зависим от маркиране на близост (PDPL), разработен чрез генетично свързване на фотосенсибилизиращия протеин miniSOG с представляващ интерес протеин.Задействан от синя светлина и контролиран от времето на експозиция, се генерира синглетен кислород и след това се постига пространствено-времево маркиране на хистидинови остатъци от анилинова сонда.Ние демонстрираме неговата висока прецизност чрез картографиране на специфични за органелите протеоми.Сравнението рамо до рамо на PDPL с TurboID показва по-специфично и изчерпателно протеомно покритие на PDPL.След това приложихме PDPL към свързания с болестта транскрипционен коактиватор BRD4 и E3 Parkin лигаза и открихме неизвестни преди това интерактори.Чрез скрининг на свръхекспресия бяха идентифицирани два неизвестни субстрата, Ssu72 и SNW1, за Parkin, чието разграждане се медиира от пътя на убиквитиниране-протеазома.
Точното характеризиране на протеиновите мрежи е в основата на много фундаментални клетъчни процеси.Следователно, високоточното пространствено-времево картографиране на протеиновите взаимодействия ще осигури молекулярна основа за дешифриране на биологични пътища, болестна патология и прекъсване на тези взаимодействия за терапевтични цели.За тази цел са много желателни методи, способни да откриват времеви взаимодействия в живи клетки или тъкани.Масспектрометрията с афинитетно пречистване (AP-MS) в миналото е била използвана за идентифициране на свързващи партньори на представляващи интерес протеини (POI).С развитието на методите на количествената протеомика беше създадена Bioplex3.0, най-голямата база данни от протеинови мрежи, базирана на AP-MS.Въпреки че AP-MS е много мощен, етапите на клетъчен лизис и разреждане в работния процес са предубедени към слаби и преходни взаимодействия на свързване и въвеждат артефакти след лизис, като фалшиви двойки взаимодействия, които нямат компартментализация преди лизис.
За справяне с тези проблеми са разработени неестествени аминокиселини (UAA) с омрежващи групи и платформи за ензимно близко маркиране (PL) (напр. APEX и BioID)5.Въпреки че методът на UAA е успешно приложен в много сценарии и предоставя информация за директни протеинови лепила, все още е необходима оптимизация на мястото на вмъкване на UAA.По-важното е, че това е стехиометричен метод за етикетиране, при който липсва каталитично обръщане на събитията за етикетиране.За разлика от това, ензимните PL методи, като метода BioID, сливат конструираната биотинова лигаза с POI7, което впоследствие активира биотина, за да образува реактивен биотинил-AMP естерен междинен продукт.По този начин ензимът катализира и освобождава активиран биотинов „облак“, който маркира проксималните лизинови остатъци.BioID обаче изисква повече от 12 часа, за да получи достатъчно маркиран сигнал, което изключва използването му с времева разделителна способност.Използвайки насочена еволюция, базирана на показване на дрожди, TurboID е проектиран на базата на BioID, за да бъде по-ефективен, позволявайки ефикасно маркиране с биотин в рамките на 10 минути, което позволява да се изследват по-динамични процеси.Тъй като TurboID е силно активен и ендогенните нива на биотин са достатъчни за маркиране на ниско ниво, фоновото маркиране се превръща в потенциален проблем, когато се изисква силно подобрено и синхронизирано маркиране чрез добавяне на екзогенен биотин.В допълнение, активираните естери са слабо реактивни (t1/2 ~5 минути), което може да доведе до голям радиус на маркиране, особено след насищане на съседни протеини с биотин 5. При друг подход, генетично сливане на конструирана аскорбат пероксидаза (т.е. биотин- фенолни радикали и позволява маркиране на протеин в рамките на една минута 9, 10. APEX се използва широко за идентифициране на субклетъчни протеоми, мембранни протеинови комплекси и цитозолни сигнални протеинови комплекси 11, 12. Въпреки това, необходимостта от високи концентрации на пероксиди може да повлияе на редокс протеини или пътища, нарушавайки клетъчни процеси.
По този начин нов метод, способен да генерира по-реактивни потискащи видове с етикетиран радиус с висока пространствена и времева точност, без значително да нарушава клетъчните пътища, ще бъде важно допълнение към съществуващите методи. Сред реактивните видове синглетният кислород привлече вниманието ни поради краткия си живот и ограничения радиус на дифузия (t1/2 <0,6 µs в клетките)13. Сред реактивните видове синглетният кислород привлече вниманието ни поради краткия си живот и ограничения радиус на дифузия (t1/2 <0,6 µs в клетките)13. Среди активните форми нашето внимание привлича синглетен кислород из-за неговото кратко време на живот и ограничен радиус на дифузия (t1/2 < 0,6 mks в клетките)13. Сред активните форми синглетният кислород привлече вниманието ни поради краткия си живот и ограничения радиус на дифузия (t1/2 <0,6 µs в клетките)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активните форми нашето внимание привлича синглетен кислород из-за неговото кратко време на живот и ограничен радиус на дифузия (t1/2 < 0,6 mks в клетките). Сред активните форми синглетният кислород привлича вниманието ни поради краткия си живот и ограничения радиус на дифузия (t1/2 <0,6 μs в клетките).Съобщава се, че синглетният кислород произволно окислява метионин, тирозин, хистидин и триптофан, което го прави полярен 14,15 за свързване към сонди на базата на амин или тиол 16,17.Въпреки че синглетният кислород е бил използван за маркиране на РНК на субклетъчния компартмент, стратегиите за повторно използване на ендогенни маркери за близост на POI остават неизследвани.Тук представяме платформа, наречена маркиране на близост в зависимост от фотоактивирането (PDPL), където използваме синя светлина за осветяване на POI, слети с фотосенсибилизатор miniSOG и задействане на генериране на синглетен кислород за окисляване на проксималните остатъци, последвано от модификации, съдържащи амин, за окисляване на химически сонди в междинни живи клетки..Тествахме група химични сонди, за да увеличим максимално специфичността на маркера и идентифицирахме местата за модификация, използвайки отворен работен поток на протеомиката.Сравнението рамо до рамо на PDPL с TurboID показва по-специфично и изчерпателно протеомно покритие на PDPL.Приложихме този подход към специфични за органелите маркери на субклетъчния протеом и обща протеомна идентификация на свързващи партньори за свързания с рака епигенетичен регулаторен протеин BRD4 и свързаната с болестта на Паркинсон E3 лигаза Parkin, което потвърди както известна, така и неизвестна мрежа от протеини взаимодействия..Способността на PDPL да разпознава E3 субстрати в големи протеинови комплекси представлява ситуация, при която се изисква разпознаване на индиректни свързващи вещества.Два неизвестни паркинови субстрата, медиирани от убиквитинираща протеазома, са потвърдени in situ.
Фотодинамичната терапия (PDT)19 и хромофор-асистираната лазерна инактивация (CALI)20, при която светлинното облъчване с фотосенсибилизатори генерира синглетен кислород, може да инактивира целевите протеини или да причини клетъчна смърт.Тъй като синглетният кислород е силно реактивно вещество с теоретично разстояние на дифузия от около 70 nm, пространствено ограниченото окисление около фотосенсибилизатора може да се контролира.Въз основа на тази концепция решихме да използваме синглетен кислород, за да постигнем близко маркиране на протеинови комплекси в живи клетки.Разработихме PDPL хемопротеомичен подход за изпълнение на четири функции: (1) за катализиране на генерирането на активен синглетен кислород, подобно на PL ензимния подход;(2) осигурява маркиране с разделяне на времето при иницииране на светлина;(3) чрез промяна (4) Избягвайте използването на ендогенни кофактори (като биотин) за намаляване на фона или използвайте силно смущаващи екзогенни реагенти (като пероксиди), за да сведете до минимум излагането на клетките на стрес от околната среда.
Фотосенсибилизаторите могат да бъдат разделени на две категории, включително флуорофори с ниско молекулно тегло (напр. бенгалска роза, метиленово синьо)22 и генетично кодирани малки протеини (напр. miniSOG, KillerRed)23.За да постигнем модулен дизайн, ние разработихме първото поколение PDPL платформа чрез добавяне на фотосенсибилизиращи (PS) протеини към POI24,25 (Фигура 1а).Когато се облъчи със синя светлина, синглетният кислород окислява проксималните нуклеофилни аминокиселинни остатъци, което води до полярност на умполунг, която е електрофилна и може допълнително да реагира с нуклеофили на аминова проба16,17.Сондата е проектирана с алкинова дръжка, за да позволи химия на щракване и издърпване надолу за LC/MS/MS характеризиране.
Схематична илюстрация на маркиране на протеинови комплекси, медиирани от miniSOG.Когато са изложени на синя светлина, клетките, експресиращи miniSOG-POI, генерират синглетен кислород, който модифицира взаимодействащите протеини, но не и несвързващите протеини.Междинните продукти на фотоокислението се улавят от релейни етикети на аминовата химическа проба, за да образуват ковалентни адукти.Алкинилната група на химическата сонда позволява щракване химия за обогатяване чрез изтегляне, последвано от LC-MS/MS количествено определяне.b Химическа структура на аминови проби 1-4.c Представителен флуоресцентен гел анализ на митохондриални локализирани miniSOG-медиирани протеомни маркери с използване на сонди 1-4 и относително количествено определяне на базата на гел денситометрия.Съотношението сигнал към фон на химически проби беше оценено с помощта на експерименти с отрицателна контрола, изключващи синя светлина или с помощта на HEK293T клетки без експресия на miniSOG.n = 2 биологично независими проби.Всяка точка представлява биологична реплика.d Представително откриване и количествено определяне на PDPL с помощта на оптимизирана сонда 3 в присъствието или отсъствието на посочените PDPL компоненти като c.n = 3 биологично независими проби.Всяка точка представлява биологична реплика.Централните линии и мустаците представляват средната стойност и ± стандартното отклонение.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Конфокално изображение на синглетен кислород с далечно червено Si-DMA оцветяване.Скала: 10 µm.Гел изображения и конфокални експерименти бяха независимо повторени поне два пъти с подобни резултати.
Първо тествахме способността на зрелите фотосенсибилизатори miniSOG26 и KillerRed23, стабилно експресирани в HEK293T, да медиират маркирането на пропаргиламин на протеома като химическа сонда (допълнителна фигура 1а).Гел флуоресцентният анализ показа, че маркирането на целия протеом е постигнато с помощта на miniSOG и облъчване със синя светлина, докато с KillerRed не се наблюдава видим продукт за маркиране.За да подобрим съотношението сигнал към фон, след това тествахме набор от химически сонди, съдържащи анилин (1 и 3), пропиламин (2) или бензиламин (4).Ние наблюдавахме, че самите HEK293T клетки имат по-висок фонов сигнал в сравнение с липсата на синя светлина, вероятно поради ендогенния рибофлавин фотосенсибилизатор, флавин мононуклеотид (FMN) 27. Базирани на анилин химични сонди 1 и 3 дават по-добра специфичност, като HEK293T стабилно експресира miniSOG в митохондриите, показвайки >8-кратно увеличение на сигнала за сонда 3, докато сонда 2, използвана в метода за РНК-маркиране CAP-seq показва само ~2,5- кратно увеличение на сигнала, вероятно поради различни предпочитания за реактивност между РНК и протеин (фиг. 1b, c). Базирани на анилин химични сонди 1 и 3 дават по-добра специфичност, като HEK293T стабилно експресира miniSOG в митохондриите, показвайки >8-кратно увеличение на сигнала за сонда 3, докато сонда 2, използвана в метода за РНК-маркиране CAP-seq показва само ~2,5- кратно увеличение на сигнала, вероятно поради различни предпочитания за реактивност между РНК и протеин (фиг. 1b, c).Базирани на анилин химични сонди 1 и 3 показват по-добра специфичност: HEK293T, който стабилно експресира miniSOG в митохондриите, показва повече от 8-кратно увеличение на сигнала за сонда 3, докато сонда 2, използвана в метода за маркиране на CAP-seq РНК, само показва ~ 2.5-кратно увеличение на сигнала, вероятно поради различни предпочитания за реактивност между РНК и протеин (фиг. 1b, c).基于苯胺的化学探针1 和3 具有更好的特异性，HEK293T 在线粒体中稳定表达miniSOG，探针3 的信号增加> 8 倍，而用于RNA 标记方法CAP-seq 的探针2 仅显示~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 中 稳定 表达 表达 表达 表达 表达 表达 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAБазирани на анилин химични сонди 1 и 3 имаха по-добра специфичност, HEK293T стабилно експресира miniSOG в митохондриите, а сонда 3 имаше над 8-кратно увеличение на сигнала, докато сонда 2 за метода за маркиране на CAP-seq РНК показа само ~2,5-кратно увеличение.в сигнала, вероятно поради различни предпочитания за реакция между РНК и протеин (фиг. 1b, c).В допълнение, изомери на сонда 3 и хидразинови сонди (сонди 5, 6, 7) бяха тествани, потвърждавайки оптимизирането на сонда 3 (допълнителна фигура 1b, c).По същия начин, флуоресцентният анализ в гел разкри други оптимизирани експериментални параметри: дължина на вълната на облъчване (460 nm), концентрация на химическа проба (1 mM) и време на облъчване (20 минути) (допълнителна фигура 2a-c).Пропускането на всеки компонент или стъпка в протокола PDPL доведе до значително обръщане на сигнала към фона (фиг. 1d).Трябва да се отбележи, че протеиновото маркиране е значително намалено в присъствието на натриев азид или тролокс, за които е известно, че гасят синглетния кислород.Наличието на D2O, за който е известно, че стабилизира синглетния кислород, усилва сигнала за маркиране.За да се изследва приносът на други реактивни кислородни видове към етикетирането, бяха добавени манитол и витамин С, за да се установят съответно уловители на хидроксилни и супероксидни радикали, 18, 29, но не беше установено, че намаляват етикетирането.Добавянето на H2O2, но не и осветяване, не доведе до етикетиране (допълнителна фигура 3а).Флуоресцентно изобразяване на синглетния кислород със Si-DMA сонди потвърди наличието на синглетен кислород в проводника HEK293T-miniSOG, но не и в оригиналния проводник HEK293T.В допълнение, mitoSOX Red не може да открие производството на супероксид след осветяване (фиг. 1e и допълнителна фигура 3b) 30. Тези данни силно предполагат, че синглетният кислород е основният реактивен кислороден вид, отговорен за последващото протеомно маркиране.Цитотоксичността на PDPL беше оценена, включително облъчване със синя светлина и химически сонди, и не беше наблюдавана значителна цитотоксичност (допълнителна фигура 4а).
За да проучим механизма на маркиране и да позволим протеомна идентификация на протеинови комплекси с помощта на LC-MS/MS, първо трябва да определим кои аминокиселини са модифицирани и делта масата на етикетите на сондата.Съобщава се, че метионин, хистидин, триптофан и тирозин са модифицирани от синглетния кислород14,15.Ние интегрираме работния процес TOP-ABPP31 с безпристрастното отворено търсене, предоставено от изчислителната платформа FragPipe, базирана на MSFragger32.След модификация на синглетния кислород и маркиране с химическа проба, химията на щракване беше извършена с помощта на етикет за редукция на биотин, съдържащ разцепващ се линкер, последвано от разтягане на неутравидин и смилане на трипсин.Модифицираният пептид, все още свързан със смолата, беше фоторазцепен за LC-MS/MS анализ (Фигура 2а и Допълнителни данни 1).Голям брой модификации са настъпили в целия протеом с изброени над 50 съвпадения на пептидна карта (PSM) (Фиг. 2b).Изненадващо, наблюдавахме само модификация на хистидин, вероятно поради по-високата реактивност на окисления хистидин към анилинови проби в сравнение с други аминокиселини.Съгласно публикувания механизъм на окисление на хистидин чрез синглетен кислород, 21, 33 предложената делта-масова структура от +229 Da съответства на адукт на проба 3 с 2-оксо-хистидин след две окисления, докато +247 Da е хидролизният продукт от +229 Da (допълнителна фигура 5).Оценката на спектъра на MS2 показа висока надеждност на идентификацията на повечето y и b йони, включително идентификацията на модифицирани фрагментни йони (y и b) (фиг. 2c).Контекстният анализ на локалната последователност на PDPL-модифицирани хистидини разкри умерено предпочитание на мотив за малки хидрофобни остатъци на ±1 позиции (допълнителна фигура 4b).Средно 1, 4 хистидина бяха идентифицирани на протеин и местата на тези маркери бяха определени чрез анализ на достъпната повърхност на разтворителя (SASA) и относителната наличност на разтворителя (RSA) (допълнителна фигура 4c, d).
Безпристрастен работен процес за изследване на остатъчна селективност с помощта на изчислителната платформа FragPipe, поддържана от MSFragger.Разцепващите се линкери се използват в Click химията, за да позволят фоторазцепване на модифицирани пептиди от стрептавидинова смола.Беше стартирано открито търсене за идентифициране на множество модификации, както и съответни остатъци.b Задайте масата на модификациите, възникващи в целия протеом.Картиране на пептиди PSM.c MS2 спектрална анотация на хистидинови места, модифицирани със сонда 3. Като представителен пример, ковалентна реакция със сонда 3 добави +229.0938 Da към модифицираната аминокиселина.d Мутационен анализ, използван за тестване на PDPL маркери.PRDX3 (H155A, H225A) и PRDX1 (H10A, H81A, H169A) бяха трансфектирани с див тип плазмиди за анти-Flag откриване.e Синтетичният пептид реагира с пречистен miniSOG в присъствието на проба 3 и съответните продукти с Δm +247 и +229 бяха отбелязани в LC-MS спектъра.f In vitro взаимодействия протеин-протеин, моделирани с miniSOG-6xHis-tag и анти-6xHis антитяло.Антибиотин (стрептавидин-HRP) и анти-миши Western blot анализ на miniSOG-6xHis/anti-6xHis антитяло комплекси, белязани със сонда 3, в зависимост от времето на излагане на светлина.Етикетите за отделни протеини се изразяват в съответното молекулно тегло: LC антитяло лека верига, HC антитяло тежка верига.Тези експерименти бяха независимо повторени поне два пъти с подобни резултати.
За биохимична проверка на мястото на маркиране, PRDX3 и PRDX1, идентифицирани чрез масспектрометрия, бяха променени от хистидин на аланин и сравнени с див тип в анализи на трансфекция.Резултатите от PDPL показват, че мутацията значително намалява етикетирането (фиг. 2d).Междувременно пептидните последователности, идентифицирани при отвореното търсене, бяха синтезирани и реагираха in vitro с пречистен miniSOG в присъствието на сонда 3 и синя светлина, като се получиха продукти с масово изместване от +247 и +229 Da, когато се откриха от LC-MS (фиг. 2д).).За да проверим дали взаимодействащите проксимални протеини могат да бъдат белязани in vitro в отговор на фотоактивиране на miniSOG, ние проектирахме анализ на изкуствена близост чрез взаимодействие между протеина miniSOG-6xHis и анти-His моноклонално антитяло in vitro (Фигура 2f).В този анализ очаквахме проксимално маркиране на тежки и леки вериги на антитяло с miniSOG.Всъщност, анти-миши (разпознаващи тежките и леките вериги на анти-6xHis-белязано антитяло) и стрептавидин Western blots показват силно биотинилиране на тежките и леките вериги.Трябва да се отбележи, че забелязахме автобиотинилиране на miniSOG, дължащо се на маркера 6xHis и напречните връзки между леките и тежките вериги, което може да е свързано с описаната по-горе разлика между проксималния отговор на лизин и 2-оксо-хистидин.В заключение, ние заключаваме, че PDPL модифицира хистидина по начин, зависим от близостта.
Следващата ни цел беше да характеризираме субклетъчния протеом, за да тестваме специфичността на маркирането in situ.Следователно, ние стабилно експресирахме miniSOG в ядрото, митохондриалната матрица или външната ER мембрана на HEK293T клетки (Фиг. 3а).Гел флуоресцентният анализ разкри обилни маркирани ленти на три субклетъчни места, както и различни модели на маркиране (Фиг. 3b).Анализът на флуоресцентно изобразяване показа висока специфичност на PDPL (фиг. 3с).Работният процес на PDPL беше последван от реакции на кликване с родаминови багрила за очертаване на субклетъчни протеоми с помощта на флуоресцентна микроскопия и PDPL сигналите бяха колокализирани с DAPI, митохондриални тракери или ER тракери, потвърждавайки високата точност на PDPL.За трите местоположения на органелите едно до друго сравнение на PDPL с TurboID с помощта на авидин Western blot показа, че PDPL е маркиран по-специфично в сравнение със съответните им контроли.При PDPL условия се появяват повече белязани ленти, което показва повече PDPL-маркирани протеини (допълнителна фигура 6a-d).
Схематично представяне на miniSOG-медиирано маркиране на специфичен за органел протеом.miniSOG е насочен към митохондриалната матрица чрез сливане с N-терминалните 23 аминокиселини на човешки COX4 (mito-miniSOG), ядрото чрез сливане с H2B (nucleus-miniSOG) и Sec61β чрез цитоплазмената страна на ER мембраната (ER-miniSOG ).Показанията включват гел изображения, конфокални изображения и масспектрометрия.b Представителни гел изображения на три специфични за органелите PDPL профила.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Представителни конфокални изображения на HEK293T клетки, стабилно експресиращи miniSOG с различни субклетъчни локализации, открити от антитяло, белязано с V5 (червено).Субклетъчните маркери се използват за митохондриите и ER (зелено).Работният процес на PDPL включва откриване на субклетъчни протеоми, маркирани с miniSOG (жълто), като се използва Cy3-азидна химия при кликване.Скала: 10 µm.d Вулканични графики на PDPL-маркирани протеоми в различни органели, количествено определени чрез небелязано количествено определяне (n = 3 независими биологични експеримента).Двустранният t-тест на Стюдънт беше използван върху графики за вулкани.HEK293T див тип беше използван като отрицателна контрола. Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет). Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет). Значително изменените белки са избрани с червен цвят (p < 0,05 и >2-кратна разница в интензивността на йоните). Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значително изменените белки са избрани с червен цвят (p < 0,05 и > 2-кратна разница в йонна сила). Значително променените протеини са подчертани в червено (р <0,05 и > 2-кратна разлика в йонната сила).Свързани протеини, важни за HEK293T-miniSOG, но не важни за HEK293T, са показани в зелено.e Анализ на спецификата на набори от протеомични данни от експерименти d.Общият брой на статистически значимите протеини във всеки органел (червени и зелени точки) е отбелязан в горната част.Хистограмите показват протеини, локализирани в органели въз основа на MitoCarta 3.0, GO анализ и A. Ting et al.хората.Отделни набори от данни за митохондрии, ядра и ER.Тези експерименти бяха независимо повторени поне два пъти с подобни резултати.Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
Окуражени от резултатите от гела и изображенията, беше използвано количествено определяне без етикети за количествено определяне на идентифицирания протеом във всяка органела (допълнителни данни 2).Нетрансфектиран HEK293T се използва като отрицателна контрола за изваждане на фонови маркери. Анализът на графиката на вулкана показва значително обогатени протеини (p <0,05 и >2-кратен йонен интензитет), както и единични протеини, които присъстват само в miniSOG-експресиращи линии (фиг. 3d червени и зелени точки). Анализът на графиката на вулкана показва значително обогатени протеини (p <0,05 и >2-кратен йонен интензитет), както и единични протеини, които присъстват само в miniSOG-експресиращи линии (фиг. 3d червени и зелени точки). Анализът на графиката на вулкана показа значително обогатени бели (p <0, 05 и > 2-кратна интензивност на йоните), както и единични бели, които присъстват само в линиите, експресиращи miniSOG (рис. 3d, червени и зелени точки). Анализът на графиката на вулкана показа значително обогатени протеини (p<0,05 и >2-кратен йонен интензитет), както и единични протеини, които присъстват само в miniSOG-експресиращи линии (фиг. 3d, червени и зелени точки).火山图分析显示出显着富集的蛋白质（p < 0.05 和>2 倍离子强度）以及仅存在于miniSOG 表达系中的单一蛋白质（图3d 红色和绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализът на графиката на вулкана откри значително обогатени бели (p <0, 05 и> 2x йонна сила), както и отделни белки, присъстващи само в експресионната линия miniSOG (червени и зелени точки на рис. 3d). Анализът на графиката на вулкана разкрива значително обогатени протеини (p<0,05 и >2x йонна сила), както и единични протеини, присъстващи само в експресионната линия miniSOG (червени и зелени точки на Фиг. 3d).Комбинирайки тези данни, ние идентифицирахме съответно 1364, 461 и 911 статистически значими ядрени, митохондриални и ER външни мембранни протеини.За да анализираме точността на локализирания в органели PDPL, използвахме MitoCarta 3.0, анализ на генна онтология (GO) и A. Ting et al.набор от данни8 беше използван за митохондрии, ядро и ER, за да се тества специфичността на органелите на откритите протеини, съответстващи на точност от 73.4, 78.5 и 73.0% (фиг. 3e).Специфичността на PDPL потвърждава, че PDPL е идеален инструмент за идентифициране на специфични за органелите протеоми.По-специално, субмитохондриалният анализ на идентифицираните митохондриални протеини показа, че уловеният протеом е разпределен главно в матрицата и вътрешната мембрана (226 и 106, съответно), което представлява 91, 7% (362) от общия брой идентифицирани митохондриални протеини.високо ниво на PDPL беше допълнително потвърдено (допълнителна фигура 7а).По същия начин субнуклеарният анализ показа, че уловеният протеом е разпределен главно в ядрото, нуклеоплазмата и ядрото (допълнителна фигура 7b).Ядреният протеомен анализ с пептид на сигнал за ядрена локализация (3xNLS) показва подобна точност на конструкцията H2B (допълнителна фигура 7c-h).За да се определи специфичността на PDPL маркера, ядреният ламинин А беше избран като по-дискретно локализиран POI7 капан.PDPL идентифицира 36 значително обогатени протеини, от които 12 протеина (30,0% включително ламин А) са добре охарактеризирани протеини, взаимодействащи с ламин А, анотирани от базата данни String, с по-висок процент от метода BioID (122 протеина) 28 от 28. , 22,9 %) 7. Нашият метод идентифицира по-малко протеини, вероятно поради ограничени зони за маркиране, което стана възможно благодарение на по-активния синглетен кислород.GO анализът показа, че идентифицираните протеини са разположени главно в нуклеоплазмата (26), ядрената мембрана (10), ядрената мембрана (9) и ядрените пори (5).Взети заедно, тези ядрено-локализирани протеини представляват 80% от обогатените протеини, допълнително демонстрирайки специфичността на PDPL (допълнителна фигура 8a-d).
След като установихме способността на PDPL да извършва маркиране на близост в органели, след това тествахме дали PDPL може да се използва за анализиране на партньори за свързване на POI.По-специално, ние се опитахме да дефинираме PDPL анализ на цитозолни протеини, които се считат за по-трудни мишени от техните мембранно-локализирани аналози поради тяхната силно динамична природа.Бромодоменът и екстратерминалният (BET) протеин BRD4 привлече вниманието ни заради ключовата си роля при различни заболявания 35, 36.Комплексът, образуван от BRD4, е транскрипционен коактиватор и важна терапевтична цел.Чрез регулиране на експресията на c-myc и Wnt5a транскрипционни фактори, BRD4 се смята за ключов фактор за остра миелоидна левкемия (AML), мултиплен миелом, лимфом на Burkitt, рак на дебелото черво и възпалителни заболявания 37, 38.В допълнение, някои вируси са насочени към BRD4 за регулиране на вирусна и клетъчна транскрипция, като папиломен вирус, ХИВ и SARS-CoV-236,39.
За да картографираме взаимодействието BRD4 с помощта на PDPL, комбинирахме miniSOG с къса N- или C-терминална изоформа на BRD4.Протеомните резултати разкриват висока степен на припокриване между двата конструкта (допълнителна фигура 9а).Ядреният протеом, идентифициран с miniSOG-H2B, покрива 77,6% от протеините, взаимодействащи с BRD4 (допълнителна фигура 9b).След това бяха използвани различни времена на осветяване (2, 5, 10, 20 минути) за регулиране на радиуса на маркера (фиг. 4а и допълнителни данни 3).Ние заключаваме, че при по-кратки фотопериоди, PDPL ще маркира предимно директни свързващи партньори, докато по-дългите периоди ще включват протеини, идентифицирани по време на по-кратки периоди на фотоактивиране, както и непреки цели в маркиращи комплекси.Всъщност открихме силно припокриване между съседни времеви точки (84,6% за 2 и 5 минути; 87,7% за 5 и 10 минути; 98,7% за 10 и 20 минути) (фиг. 4b и допълнителна фигура 9c).Във всички експериментални групи открихме не само самомаркиране на BRD4, но и няколко известни цели като MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A и HMGB1, анотирани в базата данни с низове.Йонната сила на тези цели е пропорционална на времето на експозиция (фиг. 4c и допълнителна фигура 9d).GO анализът на протеините, идентифицирани в 2-минутната група, показа, че идентифицираните протеини са локализирани в ядрото и са включени в ремоделирането на хроматина и функцията на РНК полимераза.Молекулярната функция на протеина е обогатена със свързване на хроматин или транскрипционна коактивация, в съответствие с BRD4 функцията (фиг. 4d).Анализът на протеиновото взаимодействие с активиран низ от база данни разкрива първо ниво на индиректни взаимодействия между BRD4 и HDAC семейни взаимодействащи комплекси като SIN3A, NCOR2, BCOR и SAP130 (фиг. 4e и допълнителна фигура 9e), в съответствие с BRD4 и HDAC свързващи ацетилирани хистони ..В допълнение, представителни мишени, идентифицирани от LC-MS/MS, включително Sin3A, NSUN2, Fus и SFPQ, бяха потвърдени чрез Western blotting (фиг. 4f).Наскоро се съобщава, че късата изоформа на BRD4 образува ядра със свойства на разделяне на фазата течност-течност (LLPS).Свързващите РНК протеини Fus и SFPQ медиират LLPS на различни клетъчни процеси и са идентифицирани тук като незаписани BRD4 свързващи протеини.Взаимодействието между BRD4 и SFPQ беше потвърдено от експерименти за ко-имунопреципитация (co-IP) (Фигура 4g), което предполага друг механизъм за BRD4-медиирано разделяне на фаза течност-течност, което заслужава по-нататъшно изследване.Взети заедно, тези резултати предполагат, че PDPL е идеална платформа за идентифициране на известни BRD4 взаимодействащи, както и неизвестни свързващи протеини.
Схематично представяне на miniSOG-медиирано BRD4 маркиране на близост, времена на експозиция: 2, 5, 10 и 20 минути.b Припокриване на протеини, идентифицирани при различни времена на осветяване.Протеиновото обогатяване, идентифицирано в HEK293T-miniSOG-BRD4, е статистически значимо в сравнение с див тип HEK293T.c Интензитет на йони при количествено определяне на немаркирани представителни известни BRD4-свързващи протеини по време на определеното време на експозиция.n = 3 биологично независими проби.Данните са представени като средно ± стандартно отклонение.d Генен онтологичен анализ (GO) на протеини, идентифицирани в 2-минутната група.Изброени са първите десет термина на GO.Мехурчетата са оцветени според категорията на термина GO, а размерът на мехурчетата е пропорционален на броя на протеините, намерени във всеки термин.e Анализ на низове на протеини, взаимодействащи с BRD4.Жълтите кръгове са директно лепило, а сивите кръгове са първият слой индиректно лепило.Червените линии представляват експериментално определени взаимодействия, а сините линии представляват предвидените взаимодействия.f Представителни цели за свързване на BRD4, идентифицирани в LC-MS/MS, бяха проверени чрез Western blotting.g Експериментите за коимунопреципитация потвърждават взаимодействието между SFPQ и BRD4.Тези експерименти бяха независимо повторени поне два пъти с подобни резултати.Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
В допълнение към идентифицирането на нерегистрирани POI-асоциирани мишени, ние предполагаме, че PDPL ще бъде подходящ за идентифициране на субстрати за ензими, което би изисквало характеризиране на индиректно свързващи протеини в големи комплекси за анотиране на нерегистрирани субстрати.Паркин (кодиран от PARK2) е Е3 лигаза и е известно, че мутациите в паркин причиняват автозомно рецесивна ювенилна болест на Паркинсон (AR-JP)42.Освен това паркинът е описан като основен за митофагията (митохондриална автофагия) и отстраняването на реактивни кислородни видове.Въпреки това, въпреки че са идентифицирани няколко субстрата на паркин, ролята на паркин в това заболяване остава неясна.За да се коментират неговите нехарактеризирани субстрати, PDPL беше тестван чрез добавяне на miniSOG към N- или C-края на parkin.Клетките бяха третирани с карбонил цианид протонен транспортер m-хлорофенилхидразон (CCCP) за активиране на паркин чрез пътя PINK1-Parkin.В сравнение с нашите BRD4 PDPL резултати, сливането на N-края на паркин разкрива по-голям набор от целеви протеини, въпреки че покрива по-голяма част от С-края (177 от 210) (Фигура 5a, b и Допълнителни данни 4).резултатът е в съответствие с докладите, че N-терминалните етикети могат ненормално да активират Parkin44.Изненадващо имаше само 18 припокриващи се протеина в нашите данни с публикувани AP-MS резултати за Parkin43, вероятно поради разлики между клетъчните линии и работните потоци на протеомиката.В допълнение към четири известни протеина (ARDM1, HSPA8, PSMD14 и PSMC3), идентифицирани чрез два метода (фиг. 5в)43.За по-нататъшно валидиране на резултатите от LC-MS/MS, PDPL лечение и последващо Western blotting бяха използвани за сравняване на резултатите от анализа на HEK293T родителски клетки и стабилната N-терминална линия на паркин.Неизвестни досега мишени CDK2, DUT, CTBP1 и PSMC4 бяха тествани с известно свързващо вещество, DNAJB1 (фиг. 5d).
Вулканичен график на паркин-взаимодействащи протеини в HEK293T клетки със стабилно експресиран miniSOG, слят с N- или C-края на паркин (n = 3 независими биологични експеримента).Двустранният t-тест на Стюдънт беше използван върху графики за вулкани.HEK293T се използва като отрицателна контрола. Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет). Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет). Значително изменените белки са избрани с червен цвят (p < 0,05 и >2-кратна разница в интензивността на йоните). Значително променените протеини са подчертани в червено (p <0,05 и> 2-кратна разлика в йонния интензитет).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значително изменените белки са избрани с червен цвят (p < 0,05 и > 2-кратна разница в йонна сила). Значително променените протеини са подчертани в червено (р <0,05 и > 2-кратна разлика в йонната сила).Свързани протеини, важни за HEK293T-miniSOG, но не важни за HEK293T, са показани в зелено.b Диаграма на Venn, показваща припокриващи се протеини между N-крайни и С-крайни конструкции.N-терминалните етикети могат да активират аберантно parkin и да доведат до по-разпознаваеми протеини.c Диаграма на Venn, показваща припокриващи се протеини между PDPL и AP-MS.Изброени са известни интерактори, включително 4 от 18 припокриващи се протеини и 11 от 159 протеини, специално идентифицирани в PDPL.d Представителни цели, идентифицирани чрез LC-MS/MS, бяха проверени чрез Western blotting.e Ssu72 и SNW1 бяха идентифицирани като нерегистрирани паркинови субстрати.Тези маркирани с FLAG протеинови плазмиди бяха трансфектирани в HEK293T и HEK293T-Parkin-miniSOG, последвано от третиране с CCCP в различни моменти от време.Разграждането е по-изразено в линията на свръхекспресия на Parkin.f Използвайки протеазомния инхибитор MG132, беше потвърдено, че процесът на разграждане на Ssu72 и SNW1 се медиира от протеазомно-убиквитиниране.Тези експерименти бяха независимо повторени поне два пъти с подобни резултати.Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.
По-специално, протеините, идентифицирани от PDPL, трябва да включват паркин-свързващи протеини и техните субстрати.За откриване на нерегистрирани субстрати на паркин, ние избрахме седем идентифицирани протеини (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 и SNW1) и трансфектирани плазмиди, за да изложим тези гени на нормален HEK293T и да експресираме стабилно HEK293T на miniSOG-Parkin, последвано от лечение с CCCP.Нивата на протеини Ssu72 и SNW1 бяха значително намалени в стабилната линия miniSOG-Parkin (фиг. 5е).Третирането с CCCP в продължение на 12 часа доведе до най-значимото разграждане на двата субстрата.За да се изследва дали разграждането на Ssu72 и SNW1 се регулира от протеазомно-убиквитиниране, протеазомният инхибитор MG132 беше добавен за инхибиране на протеазомната активност и всъщност открихме, че техният процес на разграждане е инхибиран (фиг. 5f).Допълнителни не-субстратни цели бяха потвърдени като интерактори на Parkin с помощта на Western blotting (допълнителна фигура 10), което показа последователни резултати с LC-MS/MS.В заключение, интегрирането на работния процес на PDPL с проверка на трансфекция на целеви протеин позволява идентифицирането на нерегистрирани E3 лигазни субстрати.
Разработихме обща платформа за маркиране на близост, която ви позволява да идентифицирате в пространството и времето взаимодействащи POI.Платформата се основава на фотосенсибилизиращия протеин miniSOG, който е само около 12 kDa, по-малко от половината от размера на зрелия ензим APEX2 (27 kDa) и една трета от размера на TurboID (35 kDa).По-малкият размер трябва значително да разшири обхвата на приложения за изучаване на малки протеинови интерактоми.Необходимо е по-нататъшно изследване на допълнителни фотосенсибилизатори, независимо дали са генетично кодирани протеини или малки молекули, за да се увеличи квантовият добив на синглетния кислород и да се разшири чувствителността на този подход.За текущата версия на miniSOG може да се постигне висока времева разделителна способност с помощта на синьо осветление за активиране на маркери за близост.В допълнение, по-дългото време на експозиция освобождава по-голям „облак“ от синглетен кислород, което води до модификация на по-дистални хистидинови остатъци, увеличен радиус на етикетиране и възможност за фина настройка на PDPL пространствената разделителна способност.Тествахме също седем химически сонди, за да увеличим съотношението сигнал-фон и проучихме молекулярния механизъм зад този подход.Работният процес TOP-ABPP, съчетан с безпристрастно отворено търсене, потвърди, че модификации са настъпили само в хистидини и не е наблюдавана последователна микросреда за увеличени модификации на хистидин, с изключение на умерено предпочитание за хистидини в областта на бримката.
PDPL също е използван за характеризиране на субклетъчни протеоми с протеомна специфичност и покритие, поне сравнимо с други методи за маркиране на близост и специфични за органелите химични проби.Маркерите за близост също са успешно използвани за характеризиране на повърхностните, лизозомните и свързаните със секретоми протеоми 46, 47.Вярваме, че PDPL ще бъде съвместим с тези субклетъчни органели.В допълнение, ние оспорихме PDPL чрез идентифициране на цели за свързване на цитозолен протеин, които са по-сложни от мембранно свързаните протеини поради техните динамични свойства и участие в повече времеви взаимодействия.PDPL се прилага към два протеина, транскрипционния коактиватор BRD4 и свързаната със заболяването лигаза E3 Parkin.Тези два протеина са избрани не само заради основните им биологични функции, но също така и заради тяхното клинично значение и терапевтичен потенциал.За тези две POI бяха идентифицирани добре познати обвързващи партньори, както и нерегистрирани цели.Трябва да се отбележи, че свързаният с разделяне на фазите протеин SFPQ беше потвърден от ко-IP, което може да показва нов механизъм, чрез който BRD4 (къса изоформа) регулира LLPS.В същото време ние вярваме, че идентифицирането на субстратите на Parkin е сценарий, при който се изисква идентифицирането на индиректни лепила.Ние идентифицирахме два неидентифицирани субстрата на паркин и потвърдихме тяхното разграждане по пътя на убиквитиниране-протеазома.Наскоро беше разработена стратегия за улавяне, базирана на механизъм, за откриване на хидролазни субстрати чрез улавянето им с ензими.Въпреки че това е много мощен метод, той не е подходящ за анализ на субстрати, участващи в образуването на големи комплекси и изисква образуването на ковалентни връзки между ензима и субстрата.Очакваме, че PDPL може да бъде разширен за изследване на други протеинови комплекси и ензимни семейства, като семействата деубиквитиназа и металопротеаза.
Нова форма на miniSOG, наречена SOPP3, е разработена с подобрено производство на синглетен кислород.Сравнихме miniSOG с SOPP3 и открихме подобрена производителност на маркиране, въпреки че съотношението сигнал/шум остана непроменено (допълнителна фигура 11).Ние предположихме, че оптимизирането на SOPP3 (напр. чрез насочена еволюция) ще доведе до по-ефективни фотосенсибилизиращи протеини, които изискват по-кратки светлинни времена и по този начин позволяват да се уловят по-динамични клетъчни процеси.Трябва да се отбележи, че настоящата версия на PDPL е ограничена до клетъчната среда, тъй като изисква осветяване със синя светлина и не може да проникне в дълбоките тъкани.Тази характеристика изключва използването му в изследвания върху животински модели.Въпреки това, комбинацията от оптогенетика с PDPL може да предостави възможност за изследване на животни, особено в мозъка.В допълнение, други инженерни инфрачервени фотосенсибилизатори също премахват това ограничение.В момента се провеждат изследвания в тази област.
Клетъчната линия HEK293T беше получена от АТСС (CRL-3216).Клетъчната линия е тествана отрицателно за микоплазмена инфекция и е култивирана в DMEM (Thermo, #C11995500BT), допълнен с 10% фетален говежди серум (FBS, Vistech, #SE100-B) и 1% пеницилин/стрептомицин (Hyclone, #SV30010).израснал в.
3-аминофенилен (проба 3) и (4-етинилфенил) метанамин (проба 4) са закупени от Bidepharm.Пропиламин (сонда 2) е закупен от Energy-chemicals.N-(2-аминофенил)пент-4-инамид (сонда 1) се синтезира съгласно публикувани методи.
Допълнителна таблица 1 изброява генетичните конструкции, използвани в това изследване.Последователностите miniSOG и KillerRed бяха клонирани от подарен плазмид от P. Zou (Пекински университет).Насочващата последователност на митохондриалната матрица е получена от 23 N-терминални аминокиселини на СОХ4 и е клонирана в посочените вектори, като се използва модул Gibson (Beyotime, #D7010S).За насочване към мембраната и ядрото на ендоплазмения ретикулум, SEC61B човешка ДНК (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), амплифицирана чрез PCR от cDNA библиотека от HEK293T клетки, и H2B ДНК (дарена от D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) и клониран, както е споменато по-горе.Освен ако не е посочено друго, други протеинови гени, използвани за трансфекция и конструиране на стабилни клетъчни линии, са PCR амплифицирани от HEK293T клетъчна cDNA библиотека.G3S (GGGS) и G4S (GGGGS) бяха използвани като линкери между протеина на примамката и miniSOG.V5 етикет за епитоп (GKPIPNPLLGLDST) беше добавен към тези слети конструкции.За експресия в бозайници и за установяване на стабилна клетъчна линия, слятата конструкция miniSOG беше субклонирана в pLX304 лентивирусен вектор.За бактериална експресия, miniSOG се клонира във вектор pET21a, белязан с 6xHis в С-края.
Клетките HEK293T се посяват при 2,0 x 105 клетки на ямка в шестямкови плаки и се трансфектират 24 часа по-късно с рекомбинантни лентивирусни плазмиди (2,4 μg pLX304) и вирусни опаковъчни плазмиди (1,5 μg psPAX2 и 1,2 μg pMD2.G) с използване на Lipo8000 (Beyotime). , #C0533), около 80% синтез.След трансфекция за една нощ, средата беше променена и инкубирана за още 24 часа.Събирането на вируса се извършва след 24, 48 и 72 часа.Преди заразяването на целевите клетъчни линии, вирусната среда се филтрува през 0, 8 μm филтър (Merck, #millex-GP) и се добавя полибрен (Solarbio, # H8761) до концентрация от 8 μg/ml.След 24 часа клетките бяха оставени да се възстановят чрез смяна на средата.Клетките бяха избрани с помощта на 5 μg/ml бластицидин (Solarbio, #3513-03-9) за първите три пасажа като по-ниска строга селекция.След това се използват 20 μg/ml като по-стриктна схема за следващите три пасажа.
Клетките се посяват в камери с 12 ямки (Ibidi, #81201) при плътност от приблизително 20 000 клетки на ямка.За да подобрите адхезията на HEK293T клетки, добавете 50 µg/ml фибронектин (Corning, #356008), разреден във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, Sangon, #B640435) при 37°C.Камерите бяха предварително обработени за 1 час и след това отстранени с PBS.След 24 часа клетките се промиват веднъж с PBS, инкубират се с 1 mM сонда 3 в свеж балансиран солев разтвор на Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) за 1 час при 37°C и след това се инкубират със син LED (460 nm). ).) бяха облъчени в продължение на 10 минути при стайна температура.След това клетките се промиват два пъти с PBS и се фиксират с 4% формалдехид в PBS (Sangon, #E672002) за 15 минути при стайна температура.Излишният формалдехид се отстранява от фиксирани клетки чрез промиване три пъти с PBS.След това клетките се пермеабилизират с 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) в PBS и се промиват 3 пъти с PBS.След това отстранете камерата и добавете към всяка проба 25 µl от щракаща реакционна смес, съдържаща 50 µM Cy3-азид (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) и 0.5 mg/ml натриев аскорбат (Aladdin, no. S105024) и се инкубират за 30 минути при стайна температура.След моментална реакция, клетките се промиват шест пъти с PBS, съдържащ 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) и след това се блокират с 5% BSA (Abcone, #B24726) в PBST за 30 минути при стайна температура.
За колокализационно имунооцветяване клетките се инкубират с първични антитела съгласно посочените условия: миши анти-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), заешки анти-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), заешко поликлонално анти-калнексиново антитяло (1:500, Abcam, #ab22595) или заешко анти-ламин A/C моноклонално антитяло (1:500; CST, #2032) при 4 °C за една нощ.След промиване 3 пъти с PBST, клетките се инкубират с вторични антитела: кози анти-заешки Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034), разреден 1:1000, кози анти-миши Alexa Fluor 594 (CST, #8889), разреден 1:1000.разреждане Разредете при стайна температура за 30 минути.След това клетките се промиват 3 пъти с PBST и се оцветяват обратно с DAPI (Thermo, #D1306) в PBS за 10 минути при стайна температура.След 3 промивания с PBS, клетките бяха запечатани в 50% глицерол (Sangon, #A600232) в PBS за изобразяване.Имунофлуоресцентни изображения бяха получени с помощта на конфокален микроскоп ZEISS LSM 900 Airyscan2 и софтуер ZNE 3.5.
За флуоресцентно изобразяване на синглетен кислород клетките се промиват два пъти с Hanks HEPES буфер преди добавяне на 100 nM Si-DMA в Hanks HEPES буфер (DOJINDO, #MT05).След излагане на светлина, клетките се инкубират в CO2 инкубатор при 37°C за 45 минути.След това клетките се промиват два пъти с HEPES буфер на Hanks и се оцветяват обратно с Hoechst в HEPES буфер на Hanks за 10 минути при стайна температура и се визуализират с помощта на ZEISS LSM 900 конфокален микроскоп., #M36008) в HBSS буфер, съдържащ калций и магнезий.След излагане на светлина или доксорубицин (MCE, #HY-15142A), клетките се инкубират в CO2 инкубатор при 37°С за 10 минути, промиват се два пъти с HBSS буфер и се инкубират с Hoechst в HBSS буфер при стайна температура.минути.Доксорубицинът се използва като контрола на положителна проба, където клетките се третират с 20 µM доксорубицин в HBSS, съдържащ 1% BSA за 30 минути.Имунофлуоресцентни изображения бяха получени с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM 900.
HEK293T клетки, стабилно експресиращи mito-miniSOG, се посяват при плътност от приблизително 30% в 15 cm панички.След 48 часа, когато се достигна ~80% сливане, клетките се промиват веднъж с PBS, инкубират се с 1 mM проба 3 в пресен HBSS буфер в продължение на 1 час при 37°C и след това се осветяват със син LED за 10 минути на стайна температура температура..След това клетките се промиват два пъти с PBS, остъргват се и се ресуспендират в ледено студен PBS буфер, съдържащ протеазни инхибитори без EDTA (MCE, #HY-K0011).Клетките бяха лизирани чрез ултразвук на върха за 1 минута (1 секунда включена и 1 секунда изключена при 35% амплитуда).Получената смес се центрофугира при 15,871 xg за 10 минути при 4°C за отстраняване на остатъците и концентрацията на супернатантата се коригира до 4 mg/mL с помощта на комплект за анализ на BCA протеин (Beyotime, #P0009).Комбинирайте 1 ml от горния лизат с 0,1 mM фоторазградим биотин азид (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA лиганд (Aladdin, #T162437) и 1 mM CuSO4 инкубатор с дъно завъртете за 1 час при стайна температура.След моментална реакция добавете сместа към предварително смесения разтвор (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) в стъклен флакон от 10 ml.Пробите се смесват и центрофугират при 4500 g за 10 минути при стайна температура.Долният и горният разтвор се изхвърлят, утайката се промива два пъти с 1 ml метанол и се центрофугира при 15871 × g за 5 минути при 4 ° С.Добавете 1 ml 8 М урея (Aladdin, № U111902) в 25 mM амониев бикарбонат (ABC, Aladdin, № A110539), за да разтворите утайката.Пробите се възстановяват с 10 mM дитиотреитол (Sangon, #A100281 в 25 mM ABC) в продължение на 40 минути при 55°C, последвано от добавяне на 15 mM пресен йодоацетамид (Sangon, #A600539) при стайна температура на тъмно.Алкилиране в рамките на 30 минути..Добавят се допълнителни 5 mM дитиотреитол, за да се спре реакцията.Пригответе приблизително 100 µl NeutrAvidin агарозни зърна (Thermo, #29202) за всяка проба чрез промиване 3 пъти с 1 ml PBS.Горният протеомен разтвор се разрежда с 5 ml PBS и се инкубира с предварително измити NeutrAvidin агарозни перли в продължение на 4 часа при стайна температура.След това зърната се промиват 3 пъти с 5 ml PBS, съдържащ 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 пъти с 5 ml PBS, съдържащ 1М урея, и 3 пъти с 5 ml ddH2O.След това зърната се събират чрез центрофугиране и се ресуспендират в 200 μl 25 mM ABC, съдържащ 1 М урея, 1 mM CaCl2 (Macklin, #C805228) и 20 ng/μl трипсин (Promega, #V5280).Трипсинизирайте една нощ при 37°C с въртене.Реакцията се спира чрез добавяне на мравчена киселина (Thermo, # A117-50), докато рН достигне 2-3.Перлите се промиват 3 пъти с 1 ml PBS, съдържащ 0.2% SDS, 3 пъти с 1 ml PBS, съдържащ 1 М урея, и след това 3 пъти с 1 ml дестилирана вода.Модифицираните пептиди се освобождават чрез лек лизис (365 nm) в продължение на 90 минути, като се използват 200 μl 70% МеОН.След центрофугиране, супернатантата се събира.След това зърната се промиват веднъж със 100 μl 70% МеОН и супернатантите се събират.Пробите се изсушават във вакуумен концентратор Speedvac и се съхраняват при -20°C до анализа.
За идентифициране и количествено определяне на синглетни кислородно модифицирани пептиди, пробите бяха повторно разтворени в 0,1% мравчена киселина и 1 μg пептиди бяха анализирани с помощта на Orbitrap Fusion Lumos Tribrid масспектрометър, оборудван с нано ESI източник от Tune и Xcalibur от софтуера на доставчика 4.3.Пробите бяха разделени на 75 µm × 15 cm капилярна колона с вътрешна опаковка с 3 µm C18 материал (ReproSil-pur, #r13.b9.) и свързани към EASY-nLC 1200 UHPLC система (Thermo).Пептидите се разделят чрез линеен 95-минутен градиент хроматография от 8% разтворител В до 50% разтворител В (А = 0,1% мравчена киселина във вода, В = 0,1% мравчена киселина в 80% ацетонитрил), след което линейно се повишава до 98% В min за 6 минути при скорост на потока 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos събира данни последователно между пълно MS сканиране и MS2 сканиране в зависимост от данните.Напрежението на разпръскване беше настроено на 2.1 kV и температурата на капиляра за транспортиране на йони беше 320°C.MS спектрите (350-2000 m/z) бяха събрани с разделителна способност 120 000, AGC 4 × 105 и максимално време на въвеждане от 150 ms.10-те най-често срещани многозаредени прекурсори при всяко пълно сканиране бяха фрагментирани с помощта на HCD с нормализирана енергия на сблъсък от 30%, квадруполен изолационен прозорец от 1,6 m/z и настройка на разделителна способност от 30 000.AGC мишена за тандемна масспектрометрия, използваща 5×104 и максимално входно време 150 ms.Динамичното изключение е зададено на 30 секунди. Неопределените йони или тези със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS. Неопределените йони или тези със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS. Неуказаните йони или йони със заряд 1+ и >7+ бяха отклонени за МС/МС. Неопределени йони или йони със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказаните йони или йони със заряди 1+ и >7+ бяха отклонени за МС/МС. Неуточнени йони или йони със заряди 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS.
Суровите данни се обработват с помощта на изчислителната платформа FragPipe, базирана на MSFragger.Отклоненията на масата и съответните аминокиселини бяха определени с помощта на отворен алгоритъм за търсене с толеранс на масата на прекурсора от -150 до 500 Da.След това модифицираните пептиди бяха идентифицирани с помощта на хистидинови модификации с увеличаване на масата от +229.0964 и +247.1069 Da в PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Клетки, стабилно експресиращи слетия miniSOG ген, се поставят в 6 cm панички.При достигане на ~80% сливане, клетките се промиват веднъж с HBSS (Gibco, #14025092), след това се инкубират с химически проби в HBSS за 1 час при 37°C и се осветяват със синя светлина.10W LED за 20 минути при стайна температура.За да се определи кой тип реактивен кислород участва в PDPL, 0,5 mM витамин C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM манитол (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 бяха добавени към клетките като добавки.След промиване със студен PBS, клетките се изстъргват, събират се в 1.5 ml центрофужни епруветки и се обработват с ултразвук с накрайник за 1 min в 200 μl PBS с 1x протеазен инхибитор без EDTA (1 s и 1 s без, амплитуда 35%).Получената смес се центрофугира при 15,871 × g в продължение на 10 минути при 4 °C и концентрацията на супернатантата се регулира до 1 mg/mL с помощта на комплект за анализ на BCA протеин.Приблизително 50 ul от горния лизат се инкубират с 0.1 mM родамин азид (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA лиганд и 1 mM CuSO4 за 1 час при стайна температура с въртене отдолу нагоре.След реакцията на щракване се извършва утаяване с ацетон чрез добавяне на 250 μl предварително охладен ацетон към пробите, инкубиране при -20 ° С за 20 минути и центрофугиране при 6010 × g за 10 минути при 4 ° С.Съберете пелетата и кипнете в 50 µl от 1x буфер на Laemmli за 10 минути при 95 °C.След това пробите се анализират върху SDS-PAGE дълги гелове и се визуализират с помощта на Bio-rad ChemiDoc MP Touch система за изображения със софтуер Image Lab Touch.
Експресията и пречистването на рекомбинантния miniSOG-6xHis протеин се извършва, както е описано по-горе.Накратко, Е. coli BL21(DE3) клетки (TransGen, #CD701-02) се трансформират с pET21a-miniSOG-6xHis и експресията на протеин се индуцира с 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).След клетъчен лизис, протеините се пречистват с помощта на Ni-NTA агарозни перли (MCE, № 70666), диализират се срещу PBS и се съхраняват при –80°C.
За базиран на антитяло in vitro анализ на близостта на етикета, смесете 100 μM пречистен miniSOG, 1 mM сонда 3 и 1 μg антибелязано мише моноклонално антитяло (TransGen, #HT501-01) в PBS до общ реакционен обем от 50 μl..Реакционната смес се облъчва със синя LED светлина за 0, 2, 5, 10 и 20 минути при стайна температура.Сместа се инкубира с 0.1 mM биотин-PEG3-азид (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA лиганд и 1 mM CuSO4 в продължение на 1 час при стайна температура върху шейкър с движение нагоре.След моментална реакция добавете 4x буфер на Laemmli директно към сместа и кипете при 95°C за 10 минути.Пробите се анализират върху SDS-PAGE гелове и се анализират чрез Western blotting със стрептавидин-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Съдържащ хистидин синтетичен пептид с С-терминално амидиране (LHDALDAK-CONH2) беше използван за анализиране на близко базирано на пептид in vitro маркиране.В този анализ 100 μM пречистен miniSOG, 10 mM проба 3 и 2 μg/ml синтетичен пептид се смесват в PBS в общ реакционен обем от 50 μl.Реакционната смес се облъчва със синя LED светлина в продължение на 1 час при стайна температура.Един микролитър проба се анализира с помощта на LC-MS система (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight масспектрометър със софтуер за спектрален анализ MassLynx).
HEK293T клетки, стабилно експресиращи слетия ген miniSOG, бяха посяти в 10 cm панички за линии с различна локализация на органелите (Mito, ER, Nucleus) и 15 cm панички за Parkin-miniSOG и BRD4-miniSOG линии.При достигане на ~90% сливане, клетките се промиват веднъж с HBSS, след това се инкубират със сонда 3 в HBSS за 1 час при 37°C и се осветяват с 10 W син LED при стайна температура.За безконтактно маркиране на Parkin, 10 цМ протон карбонил цианиден носител m-хлорофенилхидразон CCCP (Solarbio, #C6700) със сонда 3 в HBSS се добавя за 1 час при 37°C.Етапите на клетъчен лизис, химия на щракване, редукция и алкилиране са същите, както са описани по-горе, с изключение на това, че се добавят 2 mg лизат и в реакцията на щракване се използва биотин PEG3 азид вместо фоторазградим биотин азид.След обогатяване, зърната се промиват 3 пъти с 5 ml PBS, съдържащ 0.2% SDS, 3 пъти с 5 ml PBS, съдържащ 1 М урея, и 3 пъти с 5 ml PBS.След това, 2 ug трипсин се добавя към 300 ul 25 mM ABC, съдържащ 1 М урея, за да се разцепи протеинът за една нощ при 37°С.Реакцията се спира чрез добавяне на мравчена киселина до достигане на рН 2-3.След трипсинизация върху гранули, пептидният разтвор се обезсолява с помощта на SOLAµ HRP колона (Thermo, #60209-001) и се изсушава във вакуумен концентратор Speedvac.Пептидите се разтварят повторно в 0,1% мравчена киселина и 500 ng пептиди се анализират с помощта на масспектрометър Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, оборудван с нано-ESI източник, описан по-горе.Пептидите бяха разделени на търговски RP-HPLC предколони (75 μm x 2 cm) (Thermo, № 164946) и аналитични RP-HPLC колони (75 μm x 25 cm) (Thermo, № 164941), и двете напълнени с 2 μm.градиент от 8% до 35% ACN за 60 минути, след това линейно повишен до 98% B за 6 минути при дебит от 300 Nl/min.MS спектрите (350-1500 m/z) бяха събрани с разделителна способност 60 000, AGC 4 × 105 и максимално време на въвеждане от 50 ms.Избраните йони бяха последователно фрагментирани от HCD в 3 s цикъла с нормализирана енергия на сблъсък от 30%, квадруполен изолационен прозорец от 1,6 m/z и разделителна способност 15000. 5 × 104 тандемен масспектрометър AGC мишена и максимално време на инжектиране от 22 ms бяха използвани.Динамичното изключване е настроено на 45 секунди. Неопределените йони или тези със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS. Неопределените йони или тези със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS. Неуказаните йони или йони със заряд 1+ и >7+ бяха отклонени за МС/МС. Неопределени йони или йони със заряд 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказаните йони или йони със заряди 1+ и >7+ бяха отклонени за МС/МС. Неуточнени йони или йони със заряди 1+ и >7+ бяха отхвърлени за MS/MS.
Етапите на приготвяне на пробата до обогатяването на гранулите NeutrAvidin бяха същите като в LC-MS/MS анализа, описан по-горе.Приблизително 50 μg лизат се използват като вход за контрол на натоварването и 2 mg лизат се използват за реакции на щракване.След обогатяване и промиване с неутравидин, свързаните протеини се елуират чрез добавяне на 50 μl от буфера на Laemmli към перлите от агарозна смола и кипене при 95°С в продължение на 5 минути.Пробите, въведени с контролно натоварване и обогатените с гранули проби бяха анализирани чрез SDS-PAGE и прехвърлени към PVDF мембрани (Millipore, #ISEQ00010) чрез стандартни Western blot методи.Мембраните се блокират с 5% обезмаслено мляко (Sangon, #A600669) в TBS, съдържащ 0.1% tween-20 (TBST) и се инкубират последователно с първични и вторични антитела.Първичните антитела се разреждат 1:1000 в 5% обезмаслено мляко в TBST и се инкубират една нощ при 4°C.Вторичните антитела се използват в съотношение 1:5000 и се инкубират за 1 час при стайна температура.Мембраните се визуализират чрез хемилуминесценция, като се използва системата за изображения Chemidoc MP.Всички неизрязани сканирания на петна и гелове на фигурата са представени като необработени данни.
Първичните антитела, използвани в това проучване, включват заешко анти-SFPQ моноклонално антитяло (CST, № 71992), заешко анти-FUS моноклонално антитяло (CST, № 67840), заешко анти-NSUN2 поликлонално антитяло (Proteintech, № 20854-1- AP), заешко анти-mSin3A поликлонално антитяло (Abcam, #ab3479), мише анти-маркирано моноклонално антитяло (TransGen, #HT201-02), мише анти-β-актин моноклонално антитяло (TransGen, #HC201-01), заешко анти -CDK2 моноклонално антитяло (ABclonal, #A0094), заешко моноклонално антитяло към CTBP1 (ABclonal, #A11600), заешко поликлонално антитяло към DUT (ABclonal, #A2901), заешко поликлонално антитяло към PSMC4 (ABclonal, #A2505), заешко анти- DNAJB1 поликлонално антитяло (ABclonal, # A5504).Тези антитела се използват при разреждане 1:1000 в 5% обезмаслено мляко в TBST.Вторичните антитела, използвани в това проучване, включват анти-заешки IgG (TransGen, #HS101-01), анти-миши IgG (TransGen, #HS201-01) при разреждане 1:5000.
За по-нататъшно изследване дали BRD4 взаимодейства със SFPQ, стабилни HEK293T и BRD4-miniSOG клетки, свръхекспресиращи HEK293T, бяха поставени в 10 cm блюда.Клетките се промиват със студен PBS и се лизират в 1 ml Pierce IP лизисен буфер (Thermo Fisher, #87787) с протеазен инхибитор без EDTA за 30 минути при 4°С.След това лизатите се събират в 1.5 ml центрофужни епруветки и се центрофугират при 15,871 xg за 10 минути при 4°С.Супернатантата беше събрана и инкубирана с 5 ug анти-V5 белязано мише моноклонално антитяло (CST, #80076) за една нощ при 4°С.Промийте приблизително 50 µl протеинови A/G магнитни зърна (MCE, #HY-K0202) два пъти с PBS, съдържащ 0,5% Tween-20.След това клетъчните лизати се инкубират с магнитни перли в продължение на 4 часа при 4°C с въртене отдолу нагоре.След това зърната се промиват четири пъти с 1 ml PBST буфер и се варят при 95 ° С в продължение на 5 минути.Пробите се анализират върху SDS-PAGE гелове и се прехвърлят към PVDF мембрани, като се използват стандартни Western blot методи.Мембраните се блокират в 5% обезмаслено мляко в TBST и се инкубират последователно с първични и вторични антитела.Първично антитяло Заешко анти-SFPQ моноклонално антитяло (CST, #71992) се използва в съотношение 1:1000 в 5% обезмаслено мляко в TBST и се инкубира една нощ при 4°C.Анти-заешки IgG се използва в съотношение 1:5000 и се инкубира в продължение на 1 час при стайна температура.Мембраните се визуализират чрез хемилуминесценция, като се използва системата за изображения Chemidoc MP.
Всички структури, използвани за анализа на достъпната повърхност на разтворителя (SASA), са получени от Protein Data Bank (PDB)52 или AlphaFold Protein Structure Database53.Абсолютната SASA се изчислява за всеки остатък с помощта на програмата FreeSASA.Само пълни и недвусмислени SASA данни за белязан хистидин и неговите съседи бяха използвани за получаване на средната SASA за всяка структура.Относителната достъпност на разтворителя (RSA) за всеки хистидин се изчислява чрез разделяне на абсолютната стойност на SASA на емпиричната максимална възможна остатъчна повърхностна площ, достъпна за разтворителя.След това всички хистидини бяха класифицирани като скрити, ако средната RSA беше под 20%, в противен случай бяха изложени56.
Необработените файлове, получени в режим DDA, бяха търсени с помощта на Proteome Discoverer (v2.5) или MSfragger (Fragpipe v15.0) в подходящата SwissProt проверена протеинова база данни, съдържаща често срещани замърсители.Пептидите изискват пълен трипсин с две липсващи места на разцепване, карбамоил метилиране като фиксирана модификация и окисление на метионин като динамична модификация.Допустимите отклонения на теглото на прекурсора и фрагмента бяха зададени съответно на 10 ppm и 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Замърсителите бяха отстранени и протеините бяха филтрирани, за да се получи процент на фалшиво откриване от <1%. Замърсителите бяха отстранени и протеините бяха филтрирани, за да се получи процент на фалшиво откриване от <1%. Попаданията на загрязняващи вещества бяха премахнати, а белките бяха отфилтрувани, за да се получи коефициент на лошо откриване <1%. Замърсителите бяха отстранени и протеините бяха филтрирани, за да се получи процент на фалшиво откриване от <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1% 的错误发现率. Попаданията на загрязняващи вещества бяха премахнати, а белките бяха отфилтрувани за постигане на ниво на открити лоши <1%. Замърсителите бяха отстранени и протеините бяха филтрирани, за да се постигне фалшиво положителен процент от <1%.За количествен анализ без използване на етикети беше използвано нормализирано протеиново съдържание от три биологични повторения.Анализът на протеинова субклетъчна локализация беше извършен с помощта на анализ на генна онтология (GO) от DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 и бази данни, събрани и публикувани от групата Alice Ting.Картата на вулкана е получена от Персей (v1.6.15.0). Сгъваемите промени в изобилието на протеини бяха тествани за статистическа значимост с помощта на двустранен t-тест и попаденията на протеина бяха идентифицирани с промяна в изобилието >2 (освен ако не е посочено друго) и p стойност <0,05. Сгъваемите промени в изобилието на протеини бяха тествани за статистическа значимост с помощта на двустранен t-тест и попаденията на протеина бяха идентифицирани с промяна в изобилието >2 (освен ако не е посочено друго) и p стойност <0,05. Променените кратности на съдържанието на белка бяха потвърдени на статистическа значимост с помощта на двустранния t-критерий, и съвпаденията на белки бяха идентифицирани с изменение на съдържанието> 2 (ако не е посочено друго) и значением p <0,05. Сгъваемите промени в съдържанието на протеин бяха тествани за статистическа значимост с помощта на двустранен t-тест и протеиновите съвпадения бяха идентифицирани с промяна на съдържанието >2 (освен ако не е отбелязано друго) и стойност на ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 的 丰度 变化> 2 （除非 另 说明） 和 和 P 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 丰度 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 变化 （另 说明） 和 P 值 <0,05。 Статистическата значимост на кратните промени на съдържанието на белка се проверява с помощта на двустранния t-критерий, а съвпадащите белки се определят за промени на съдържанието > 2 (ако не е указано ино) и p-значение <0,05. Статистическата значимост на кратните промени в съдържанието на протеин беше тествана с помощта на двустранен t-тест и протеиновите съвпадения бяха определени за промени в съдържанието >2 (освен ако не е посочено друго) и p-стойности <0,05.Анализът на протеиновото взаимодействие беше извършен с помощта на GO анализ заедно с базата данни String.
Проведени са три биологични повторения с подобни резултати.Статистическият анализ беше извършен с GraphPad Prism (софтуер GraphPad) и графиките на вулканите бяха генерирани с Perseus (v1.6.15.0).За да се сравнят двете групи, p-стойностите бяха определени с помощта на двустранен t-тест на Student.Само единични протеини, идентифицирани поне два пъти в експерименталната група, бяха включени в диаграмите на вулкана и съответните липсващи стойности в контролната група бяха заменени с Perseus от нормално разпределение, така че p-стойността да може да бъде изчислена.Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.При протеомни анализи за статистически анализ изобилието от протеини, които се появяват в най-малко две биологични реплики, се запазва.Не са използвани статистически методи за предварително определяне на размера на извадката.Експериментите не са случайни.Изследователите не останаха слепи за задачите по време на експеримента и оценката на резултатите.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за изследване на природата, свързано с тази статия.
Масспектрометричните данни, получени в това проучване, бяха изпратени на ProteomeXchange Consortium чрез партньорското хранилище на iProX57 под ID на набор от данни PXD034811 (набор от данни PDPL-MS).Суровите данни се предоставят под формата на файлове с необработени данни.Тази статия предоставя оригиналните данни.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Запознаване с квартала: използване на зависимо от близостта биотинилиране за характеризиране на протеинови комплекси и картографиране на органели. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Запознаване с квартала: използване на зависимо от близостта биотинилиране за характеризиране на протеинови комплекси и картографиране на органели.Gingras, AS, Abe, KT и Raut, B. Познаване на околната среда: използване на зависимо от близостта биотинилиране за характеризиране на протеинови комплекси и картографиране на органели. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘制细胞器图。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Разбиране на квартала: използвайте зависимостта на квартала от биологичния живот.Gingras, AS, Abe, KT и Raut, B. Разбиране на близостта: характеризиране на протеинови комплекси и картографиране на органели, използвайки зависимо от близостта биотинилиране.Текущ.Моето мнение.химически.биология 48, 44–54 (2019).
Geri, JB и др.Картографиране на микросредата чрез прехвърляне на енергията на Dexter към имунните клетки.Наука 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Двупротеомни мащабни мрежи откриват клетъчно-специфично ремоделиране на човешкия интерактом.Клетки 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Време на публикуване: 15 септември 2022 г
