Новини

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Ефективните фотосенсибилизатори са особено важни за широкото клинично приложение на фототерапията.Обаче конвенционалните фотосенсибилизатори обикновено страдат от абсорбция на къса дължина на вълната, недостатъчна фотостабилност, нисък квантов добив на реактивни кислородни видове (ROS) и индуцирано от агрегацията охлаждане на ROS.Тук докладваме за близък инфрачервен (NIR) надмолекулен фотосенсибилизатор (RuDA), медииран от самосглобяване на органометални комплекси Ru(II)-арен във воден разтвор.RuDA може да генерира само синглетен кислород (1O2) в агрегирано състояние и проявява очевидно предизвикано от агрегацията поведение при генериране на 1O2 поради значително увеличаване на процеса на кръстосване между синглетно-триплетната система.Под действието на 808 nm лазерна светлина, RuDA проявява 1O2 квантов добив от 16,4% (одобрено от FDA индоцианиново зелено: ΦΔ=0,2%) и висока фототермична ефективност на преобразуване от 24,2% (комерсиални златни нанопръчки) с отлична фотостабилност.: 21,0%, златни наночерупки: 13,0%).В допълнение, RuDA-NPs с добра биосъвместимост могат преференциално да се натрупват в туморните места, причинявайки значителна туморна регресия по време на фотодинамична терапия с 95,2% намаление на обема на тумора in vivo.Тази фотодинамична терапия, подобряваща агрегацията, осигурява стратегия за разработване на фотосенсибилизатори с благоприятни фотофизични и фотохимични свойства.
В сравнение с конвенционалната терапия, фотодинамичната терапия (PDT) е привлекателно лечение за рак поради значителните си предимства като точен пространствено-времеви контрол, неинвазивност, незначителна лекарствена резистентност и минимизиране на страничните ефекти 1,2,3.При светлинно облъчване, използваните фотосенсибилизатори могат да се активират, за да образуват силно реактивни кислородни видове (ROS), което води до апоптоза/некроза или имунни отговори4,5. Въпреки това, повечето конвенционални фотосенсибилизатори, като хлорини, порфирини и антрахинони, имат относително късо поглъщане на вълната (честота < 680 nm), което води до лошо проникване на светлина поради интензивното поглъщане на биологични молекули (напр. хемоглобин и меланин) в видимата област6,7. Въпреки това, повечето конвенционални фотосенсибилизатори, като хлорини, порфирини и антрахинони, имат относително късо поглъщане на вълната (честота < 680 nm), което води до лошо проникване на светлина поради интензивното поглъщане на биологични молекули (напр. хемоглобин и меланин) в видимата област6,7. Въпреки това повечето обикновени фотосенсибилизатори, като хлорини, порфирини и антрахинони, притежават относително краткотрайно поглъщане (частота < 680 nm), което води до лошо проникване на света от интензивно поглъщане на биологични молекули (например гемоглобин и меланин) във видима област6,7. Въпреки това, най-често срещаните фотосенсибилизатори като хлорини, порфирини и антрахинони имат относително къса абсорбция на вълната (< 680 nm), което води до лошо проникване на светлина поради интензивна абсорбция на биологични молекули (напр. хемоглобин и меланин) във видимата област6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率< 680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收，导致光穿透性差。然而 ， 大多数 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 较 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 nm） 因此 由于 对 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 的 ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Въпреки това повечето традиционни фотосенсибилизатори, като хлорини, порфирини и антрахинони, имат относително краткотрайно поглощение (честота < 680 nm) поради силното поглъщане на биомолекул, като гемоглобин и меланин, което води до лошо проникване на света. Въпреки това повечето традиционни фотосенсибилизатори като хлорини, порфирини и антрахинони имат относително къса абсорбция на вълната (честота < 680 nm) поради силна абсорбция на биомолекули като хемоглобин и меланин, което води до слабо проникване на светлина.Видима площ 6.7.Следователно фотосенсибилизаторите, абсорбиращи близката инфрачервена светлина (NIR), които се активират в „терапевтичния прозорец“ от 700–900 nm, са много подходящи за фототерапия.Тъй като близката инфрачервена светлина се абсорбира най-малко от биологичните тъкани, тя може да доведе до по-дълбоко проникване и по-малко фотоувреждане8,9.
За съжаление, съществуващите фотосенсибилизатори, абсорбиращи NIR, обикновено имат лоша фотостабилност, нисък капацитет за генериране на синглетен кислород (1O2) и индуцирано от агрегацията гасене на 1O2, което ограничава тяхното клинично приложение 10,11.Въпреки че са положени големи усилия за подобряване на фотофизичните и фотохимичните свойства на конвенционалните фотосенсибилизатори, досега няколко доклада съобщават, че фотосенсибилизаторите, абсорбиращи NIR, могат да решат всички тези проблеми.В допълнение, няколко фотосенсибилизатора показаха обещание за ефективно генериране на 1O212,13,14 при облъчване със светлина над 800 nm, тъй като фотонната енергия намалява бързо в близката инфрачервена област.Трифениламин (TFA) като донор на електрони и [1,2,5]тиадиазол-[3,4-i]дипиридо[a,c]феназин (TDP) като акцепторна група на електрони Багрила тип донор-акцептор (DA) клас на багрила, абсорбиращи близкото инфрачервено лъчение, които са обстойно проучени за близко инфрачервено биоизобразяване II и фототермална терапия (PTT) поради тесния им обхват.По този начин, DA-тип багрила могат да се използват за PDT с близко IR възбуждане, въпреки че те рядко са били изследвани като фотосенсибилизатори за PDT.
Добре известно е, че високата ефективност на междусистемното кръстосване (ISC) на фотосенсибилизаторите насърчава образуването на 1O2.Обща стратегия за напредване на ISC процеса е да се подобри спин-орбиталното свързване (SOC) на фотосенсибилизаторите чрез въвеждане на тежки атоми или специални органични части.Този подход обаче все още има някои недостатъци и ограничения19,20.Наскоро супрамолекулното самосглобяване предостави интелигентен подход отдолу нагоре за производството на функционални материали на молекулярно ниво, 21, 22 с многобройни предимства във фототерапията: (1) самосглобяващите се фотосенсибилизатори могат да имат потенциала да образуват лентови структури.Подобно на електронните структури с по-плътно разпределение на енергийните нива поради припокриващи се орбити между градивните елементи.Следователно енергийното съвпадение между долното синглетно възбудено състояние (S1) и съседното триплетно възбудено състояние (Tn) ще бъде подобрено, което е от полза за ISC процеса 23, 24.(2) Надмолекулното сглобяване ще намали нерадиационната релаксация въз основа на механизма за ограничаване на вътремолекулярното движение (RIM), който също насърчава ISC процеса 25, 26.(3) Надмолекулният комплект може да защити вътрешните молекули на мономера от окисляване и разграждане, като по този начин значително подобрява фотостабилността на фотосенсибилизатора.Като се имат предвид горните предимства, ние вярваме, че супрамолекулните фотосенсибилизиращи системи могат да бъдат обещаваща алтернатива за преодоляване на недостатъците на PDT.
Базираните на Ru(II) комплекси са обещаваща медицинска платформа за потенциални приложения в диагностиката и терапията на заболявания поради техните уникални и атрактивни биологични свойства28,29,30,31,32,33,34.В допълнение, изобилието от възбудени състояния и регулируемите фотофизикохимични свойства на комплекси, базирани на Ru (II), осигуряват големи предимства за разработването на фотосенсибилизатори, базирани на Ru (II) 35, 36, 37, 38, 39, 40.Забележителен пример е рутений (II) полипиридил комплекс TLD-1433, който в момента е във Фаза II клинични изпитвания като фотосенсибилизатор за лечение на немускулно инвазивен рак на пикочния мехур (NMIBC)41.В допълнение, органометалните комплекси с рутений (II) арен се използват широко като химиотерапевтични средства за лечение на рак поради тяхната ниска токсичност и лекота на модификация 42, 43, 44, 45.Йонните свойства на Ru(II)-арен органометалните комплекси могат не само да подобрят лошата разтворимост на DA хромофорите в обикновени разтворители, но също така да подобрят сглобяването на DA хромофорите.В допълнение, псевдооктаедричната полусандвич структура на органометалните комплекси на Ru (II) -арени може стерично да предотврати Н-агрегирането на DA-тип хромофори, като по този начин улеснява образуването на J-агрегиране с червено изместени абсорбционни ленти.Въпреки това, присъщите недостатъци на Ru(II)-аренови комплекси, като ниска стабилност и/или лоша бионаличност, могат да повлияят на терапевтичната ефикасност и in vivo активността на арен-Ru(II) комплексите.Проучванията обаче показват, че тези недостатъци могат да бъдат преодолени чрез капсулиране на рутениеви комплекси с биосъвместими полимери чрез физическо капсулиране или ковалентно конюгиране.
В тази работа ние докладваме DA-конюгирани комплекси на Ru (II) -арен (RuDA) с NIR тригер чрез координационна връзка между DAD хромофора и Ru (II) -ареновата част.Получените комплекси могат да се самосглобяват в металосупрамолекулни везикули във вода поради нековалентни взаимодействия.Трябва да се отбележи, че супрамолекулният монтаж надари RuDA с индуцирани от полимеризация междусистемни свойства на кръстосване, което значително увеличи ефективността на ISC, което беше много благоприятно за PDT (фиг. 1A).За да се увеличи натрупването на тумор и in vivo биосъвместимостта, одобреният от FDA Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) беше използван за капсулиране на RuDA47,48,49 за създаване на наночастици RuDA-NP (Фигура 1B), които действаха като високоефективен PDT/Dual- режим PTT прокси.При фототерапия на рак (Фигура 1C), RuDA-NP се използва за лечение на голи мишки с MDA-MB-231 тумори за изследване на ефикасността на PDT и PTT in vivo.
Схематична илюстрация на фотофизичния механизъм на RuDA в мономерни и агрегирани форми за фототерапия на рак, синтез на B RuDA-NPs и C RuDA-NPs за NIR-активиран PDT и PTT.
RuDA, състоящ се от TPA и TDP функционалност, се приготвя съгласно процедурата, показана на допълнителна фигура 1 (фигура 2A), и RuDA се характеризира с 1H и 13C NMR спектри, електроспрей йонизационна масова спектрометрия и елементен анализ (допълнителни фигури 2-4 ).Картата на разликата в електронната плътност RuDA на най-ниския синглет преход беше изчислена чрез теорията на зависимата от времето функционална плътност (TD-DFT), за да се проучи процеса на пренос на заряда.Както е показано на допълнителна фигура 5, електронната плътност се движи главно от трифениламин към TDP акцепторната единица след фотовъзбуждане, което може да се припише на типичен преход на вътрешномолекулен трансфер на заряд (CT).
Химическа структура на руда. B Абсорбционни спектри на руда в смеси с различни съотношения на DMF и вода.C Нормализирани стойности на абсорбция на RuDA (800 nm) и ICG (779 nm) спрямо времето при 0,5 W cm-2 на 808 nm лазерна светлина.D Фоторазграждането на ABDA се показва чрез индуцирано от RuDA образуване на 1O2 в смеси DMF/H2O с различно водно съдържание под действието на лазерно лъчение с дължина на вълната 808 nm и мощност 0,5 W/cm2.
Резюме — UV-видима абсорбционна спектроскопия е използвана за изследване на свойствата на самосглобяване на руда в смеси от DMF и вода в различни съотношения.Както е показано на фиг.2B, RuDA проявява абсорбционни ивици от 600 до 900 nm в DMF с максимална абсорбционна лента при 729 nm.Увеличаването на количеството вода доведе до постепенно червено изместване на максимума на абсорбцията на руда до 800 nm, което показва J-агрегиране на руда в сглобената система.Спектрите на фотолуминесценция на RuDA в различни разтворители са показани на допълнителна фигура 6. Изглежда, че RuDA проявява типична NIR-II луминесценция с максимална дължина на вълната на излъчване от около.1050 nm в CH2Cl2 и CH3OH, съответно.Голямото изместване на Стокс (около 300 nm) на RuDA показва значителна промяна в геометрията на възбуденото състояние и образуването на нискоенергийни възбудени състояния.Квантовите добиви на луминесценция на руда в CH2Cl2 и CH3OH бяха определени съответно на 3,3 и 0,6%.Въпреки това, в смес от метанол и вода (5/95, v/v), се наблюдава леко червено изместване на емисиите и намаляване на квантовия добив (0,22%), което може да се дължи на самосглобяването на руда .
За да визуализираме самосглобяването на ORE, използвахме течна атомно-силова микроскопия (AFM), за да визуализираме морфологичните промени в ORE в разтвор на метанол след добавяне на вода.Когато водното съдържание е под 80%, не се наблюдава ясно агрегиране (допълнителна фигура 7).Въпреки това, с по-нататъшно увеличаване на водното съдържание до 90–95%, се появяват малки наночастици, което показва самосглобяването на руда. В допълнение, лазерното облъчване с дължина на вълната 808 nm не повлиява интензитета на абсорбция на RuDA във воден решение (фиг. 2C и допълнителна фигура 8).За разлика от това, абсорбцията на индоцианиново зелено (ICG като контрола) спадна бързо при 779 nm, което показва отлична фотостабилност на RuDA.В допълнение, стабилността на RuDA-NPs в PBS (рН = 5.4, 7.4 и 9.0), 10% FBS и DMEM (висока глюкоза) беше изследвана чрез UV-видима абсорбционна спектроскопия в различни моменти от време.Както е показано на допълнителна фигура 9, леки промени в ивиците на абсорбция на RuDA-NP са наблюдавани в PBS при pH 7.4/9.0, FBS и DMEM, което показва отлична стабилност на RuDA-NP.Въпреки това, в кисела среда (рН = 5,4) се установява хидролиза на руда.Ние също така допълнително оценихме стабилността на RuDA и RuDA-NP, използвайки методите на високоефективна течна хроматография (HPLC).Както е показано на допълнителна фигура 10, RuDA е стабилен в смес от метанол и вода (50/50, v/v) за първия час и хидролиза се наблюдава след 4 часа.Въпреки това, само широк вдлъбнат-изпъкнал пик се наблюдава за RuDA NP.Следователно, гел проникваща хроматография (GPC) беше използвана за оценка на стабилността на RuDA NPs в PBS (рН = 7.4).Както е показано на допълнителна фигура 11, след 8 часа инкубация при тестваните условия, височината на пика, ширината на пика и площта на пика на NP RuDA не се променят значително, което показва отлична стабилност на NP RuDA.В допълнение, ТЕМ изображенията показват, че морфологията на наночастиците RuDA-NP остава почти непроменена след 24 часа в разреден PBS буфер (рН = 7.4, допълнителна фигура 12).
Тъй като самосглобяването може да придаде различни функционални и химични характеристики на рудата, наблюдавахме освобождаването на 9,10-антрацендиилбис(метилен)дималонова киселина (ABDA, индикатор 1O2) в смеси метанол-вода.Руда с различно водно съдържание50.Както е показано на Фигура 2D и Допълнителна Фигура 13, не се наблюдава разграждане на ABDA, когато водното съдържание е под 20%.С повишаване на влажността до 40%, настъпва разграждане на ABDA, както се вижда от намаляване на интензитета на флуоресценцията на ABDA.Също така се наблюдава, че по-високото водно съдържание води до по-бързо разграждане, което предполага, че самосглобяването на RuDA е необходимо и полезно за разграждането на ABDA.Това явление е много различно от съвременните хромофори ACQ (предизвикано от агрегацията охлаждане).При облъчване с лазер с дължина на вълната 808 nm, квантовият добив на 1O2 RuDA в смес от 98% H2O/2% DMF е 16,4%, което е 82 пъти по-високо от това на ICG (ΦΔ = 0,2%)51, демонстрирайки забележителна ефективност на генериране 1O2 RuDA в състояние на агрегиране.
Електронни завъртания, използващи 2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидинон (TEMP) и 5,5-диметил-1-пиролин N-оксид (DMPO) като спинови капани Резонансната спектроскопия (ESR) беше използвана за идентифициране на получените видове AFK.от RuDA.Както е показано на допълнителна фигура 14, беше потвърдено, че 1O2 се генерира при време на облъчване между 0 и 4 минути.В допълнение, когато RuDA се инкубира с DMPO при облъчване, се открива типичен четириредов EPR сигнал от 1:2:2:1 DMPO-OH· адукт, което показва образуването на хидроксилни радикали (OH·).Като цяло, горните резултати демонстрират способността на RuDA да стимулира производството на ROS чрез двоен процес на фотосенсибилизация тип I/II.
За да се разберат по-добре електронните свойства на RuDA в мономерни и агрегирани форми, граничните молекулярни орбитали на RuDA в мономерни и димерни форми бяха изчислени с помощта на метода DFT.Както е показано на фиг.3А, най-високата заета молекулярна орбитала (HOMO) на мономерния RuDA е делокализирана по гръбнака на лиганда, а най-ниската незаета молекулярна орбитала (LUMO) е центрирана върху TDP акцепторната единица.Напротив, електронната плътност в димерния HOMO е концентрирана върху лиганда на една RuDA молекула, докато електронната плътност в LUMO е концентрирана главно върху акцепторната единица на друга RuDA молекула, което показва, че RuDA е в димера.Характеристики на КТ.
A HOMO и LUMO на Ore се изчисляват в мономерни и димерни форми.B Синглетни и триплетни енергийни нива на руда в мономери и димери.C Прогнозирани нива на RuDA и възможни ISC канали като мономерни C и димерни D. Стрелките показват възможни ISC канали.
Разпределението на електрони и дупки в нискоенергийните синглетни възбудени състояния на RuDA в мономерните и димерните форми беше анализирано с помощта на софтуера Multiwfn 3.852.53, които бяха изчислени с помощта на метода TD-DFT.Както е посочено на допълнителния етикет.Както е показано на фигури 1-2, мономерните RDA дупки са предимно делокализирани по гръбнака на лиганда в тези синглетно възбудени състояния, докато електроните са разположени предимно в TDP групата, демонстрирайки вътрешномолекулните характеристики на CT.В допълнение, за тези синглетно възбудени състояния има повече или по-малко припокриване между дупки и електрони, което предполага, че тези синглетно възбудени състояния имат известен принос от локално възбуждане (LE).За димерите, в допълнение към вътрешномолекулните CT и LE характеристики, определена част от междумолекулните CT характеристики се наблюдават в съответните състояния, особено S3, S4, S7 и S8, въз основа на междумолекулен CT анализ, с CT междумолекулни преходи като основни (Допълнителна таблица).3).
За да разберем по-добре експерименталните резултати, ние допълнително проучихме свойствата на възбудените състояния на RuDA, за да изследваме разликите между мономери и димери (допълнителни таблици 4–5).Както е показано на фигура 3B, енергийните нива на синглетните и триплетните възбудени състояния на димера са много по-плътни от тези на мономера, което помага да се намали енергийната разлика между S1 и Tn. Докладвано е, че ISC преходите могат да бъдат реализирани в рамките на малка енергийна празнина (ΔES1-Tn <0.3 eV) между S1 и Tn54. Докладвано е, че ISC преходите могат да бъдат реализирани в рамките на малка енергийна празнина (ΔES1-Tn <0.3 eV) между S1 и Tn54. Съобщава се, че преходите на ISC могат да бъдат реализирани в малки граници на енергийната клетка (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. Съобщава се, че ISC преходите могат да бъдат реализирани в рамките на малка енергийна празнина (ΔES1-Tn <0.3 eV) между S1 и Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Съобщава се, че преходът ISC може да бъде реализиран в рамките на малка енергийна клетка (ΔES1-Tn < 0,3 эВ) между S1 и Tn54. Съобщава се, че ISC преходът може да се реализира в рамките на малка енергийна празнина (ΔES1-Tn <0.3 eV) между S1 и Tn54.В допълнение, само една орбитала, заета или незаета, трябва да се различава в свързани синглетни и триплетни състояния, за да осигури ненулев SOC интеграл.По този начин, въз основа на анализа на енергията на възбуждане и орбиталния преход, всички възможни канали на ISC прехода са показани на фиг.3C,D.По-специално, само един ISC канал е наличен в мономера, докато димерната форма има четири ISC канала, които могат да подобрят ISC прехода.Следователно е разумно да се предположи, че колкото повече RuDA молекули са агрегирани, толкова по-достъпни ще бъдат ISC каналите.Следователно, RuDA агрегатите могат да образуват двулентови електронни структури в синглетно и триплетно състояние, намалявайки енергийната разлика между S1 и наличния Tn, като по този начин повишават ефективността на ISC за улесняване на генерирането на 1O2.
За по-нататъшно изясняване на основния механизъм, ние синтезирахме референтно съединение на арен-Ru(II) комплекса (RuET) чрез заместване на две етилови групи с две трифениламинови фенилни групи в RuDA (Фиг. 4A, за пълна характеристика, вижте ESI, Допълнителен 15 -21 ) От донор (диетиламин) до акцептор (TDF), RuET има същите вътрешномолекулни CT характеристики като RuDA.Както се очакваше, абсорбционният спектър на RuET в DMF показа лента за пренос на заряд с ниска енергия със силна абсорбция в близката инфрачервена област в областта от 600–1100 nm (фиг. 4B).В допълнение, агрегацията на RuET също се наблюдава с увеличаване на водното съдържание, което се отразява в червеното изместване на максимума на абсорбция, което беше допълнително потвърдено от течно AFM изображение (допълнителна фигура 22).Резултатите показват, че RuET, подобно на RuDA, може да образува вътрешномолекулни състояния и да се самосглобява в агрегирани структури.
Химическа структура на RuET.B Абсорбционни спектри на RuET в смеси с различни съотношения на DMF и вода.Парцели C EIS Nyquist за RuDA и RuET.Фототокови реакции D на RuDA и RuET под действието на лазерно лъчение с дължина на вълната 808 nm.
Фоторазграждането на ABDA в присъствието на RuET се оценява чрез облъчване с лазер с дължина на вълната 808 nm.Изненадващо, не се наблюдава разграждане на ABDA в различни водни фракции (допълнителна фигура 23).Възможна причина е, че RuET не може ефективно да образува лентова електронна структура, тъй като етиловата верига не насърчава ефективен междумолекулен трансфер на заряд.Поради това бяха извършени измервания на електрохимична импедансна спектроскопия (EIS) и преходни фототокове, за да се сравнят фотоелектрохимичните свойства на RuDA и RuET.Според диаграмата на Найкуист (Фигура 4C), RuDA показва много по-малък радиус от RuET, което означава, че RuDA56 има по-бърз междумолекулен електронен транспорт и по-добра проводимост.В допълнение, плътността на фототока на RuDA е много по-висока от тази на RuET (фиг. 4D), потвърждавайки по-добрата ефективност на пренос на заряд на RuDA57.По този начин фениловата група на трифениламина в Ore играе важна роля в осигуряването на междумолекулен трансфер на заряд и образуването на лентова електронна структура.
За да увеличим натрупването на тумор и in vivo биосъвместимостта, ние допълнително капсулирахме RuDA с F127.Средният хидродинамичен диаметър на RuDA-NPs беше определен на 123,1 nm с тясно разпределение (PDI = 0,089), използвайки метода на динамично разсейване на светлината (DLS) (Фигура 5А), който насърчава натрупването на тумор чрез увеличаване на пропускливостта и задържането.EPR) ефект.TEM изображенията показват, че Ore NP имат еднаква сферична форма със среден диаметър 86 nm.По-специално, максимумът на абсорбция на RuDA-NPs се появява при 800 nm (допълнителна фигура 24), което показва, че RuDA-NPs могат да запазят функциите и свойствата на самосглобяващите се RuDAs.Изчисленият квантов добив на ROS за NP Ore е 15,9%, което е сравнимо с Ore. Фототермичните свойства на RuDA NPs са изследвани под действието на лазерно лъчение с дължина на вълната 808 nm с помощта на инфрачервена камера.Както е показано на фиг.5B, C, контролната група (само PBS) има леко повишаване на температурата, докато температурата на разтвора на RuDA-NPs се повишава бързо с повишаване на температурата (ΔT) до 15.5, 26.1 и 43.0°C.Високите концентрации са съответно 25, 50 и 100 µM, което показва силен фототермичен ефект на RuDA NP.Освен това бяха направени измервания на цикъла на отопление/охлаждане, за да се оцени фототермичната стабилност на RuDA-NP и да се сравни с ICG.Температурата на Ore NPs не намалява след пет цикъла на нагряване/охлаждане (фиг. 5D), което показва отличната фототермична стабилност на Ore NPs.За разлика от това, ICG проявява по-ниска фототермична стабилност, както се вижда от очевидното изчезване на фототермичното температурно плато при същите условия.Съгласно предишния метод58, ефективността на фототермично преобразуване (PCE) на RuDA-NP е изчислена като 24,2%, което е по-високо от съществуващите фототермични материали като златни нанопръчки (21,0%) и златни наночерупки (13,0%)59.По този начин NP Ore показват отлични фототермични свойства, което ги прави обещаващи PTT агенти.
Анализ на DLS и TEM изображения на RuDA NP (вмъкване).B Термични изображения на различни концентрации на RuDA NPs, изложени на лазерно лъчение при дължина на вълната 808 nm (0,5 W cm-2).C Криви на фототермично преобразуване на различни концентрации на рудни НЧ, които са количествени данни.B. D Повишаване на температурата на ORE NP и ICG за 5 цикъла нагряване-охлаждане.
Фотоцитотоксичността на RuDA NP срещу MDA-MB-231 човешки ракови клетки на гърдата беше оценена in vitro.Както е показано на фиг.6A, B, RuDA-NPs и RuDA показват незначителна цитотоксичност при липса на облъчване, което предполага по-ниска тъмна токсичност на RuDA-NPs и RuDA.Въпреки това, след излагане на лазерно лъчение при дължина на вълната от 808 nm, RuDA и RuDA NPs показват силна фотоцитотоксичност срещу MDA-MB-231 ракови клетки със стойности на IC50 (половин максимална инхибиторна концентрация) от 5,4 и 9,4 μM, съответно, демонстрирайки че RuDA-NP и RuDA имат потенциал за фототерапия на рак.В допълнение, фотоцитотоксичността на RuDA-NP и RuDA беше допълнително изследвана в присъствието на витамин С (Vc), поглъщащ ROS, за да се изясни ролята на ROS в индуцираната от светлина цитотоксичност.Очевидно клетъчната жизнеспособност се увеличава след добавянето на Vc и стойностите на IC50 на RuDA и RuDA NP са съответно 25, 7 и 40, 0 μM, което доказва важната роля на ROS във фотоцитотоксичността на RuDA и RuDA NP.Индуцирана от светлина цитотоксичност на RuDA-NPs и RuDA в MDA-MB-231 ракови клетки чрез оцветяване на живи/мъртви клетки с помощта на калцеин AM (зелена флуоресценция за живи клетки) и пропидиев йодид (PI, червена флуоресценция за мъртви клетки).потвърдено от клетки) като флуоресцентни сонди.Както е показано на фигура 6C, клетките, третирани с RuDA-NP или RuDA, остават жизнеспособни без облъчване, както се вижда от интензивна зелена флуоресценция.Напротив, при лазерно облъчване се наблюдава само червена флуоресценция, което потвърждава ефективната фотоцитотоксичност на RuDA или RuDA NPs.Трябва да се отбележи, че зелена флуоресценция се появява при добавяне на Vc, което показва нарушение на фотоцитотоксичността на RuDA и RuDA NPs.Тези резултати са в съответствие с in vitro тестовете за фотоцитотоксичност.
Дозозависима жизнеспособност на A RuDA- и B RuDA-NP клетки в MDA-MB-231 клетки в присъствието или отсъствието на Vc (0.5 mM), съответно.Ленти за грешки, средна стойност ± стандартно отклонение (n = 3). Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарни двустранни t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарни двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.C Анализ на оцветяване на живи/мъртви клетки с използване на калцеин AM и пропидиев йодид като флуоресцентни сонди.Скала: 30 µm.Показани са представителни изображения на три биологични повторения от всяка група.D Конфокални флуоресцентни изображения на производството на ROS в клетки MDA-MB-231 при различни условия на лечение.Зелената DCF флуоресценция показва наличието на ROS.Облъчва се с лазер с дължина на вълната 808 nm с мощност 0,5 W/cm2 за 10 минути (300 J/cm2).Скала: 30 µm.Показани са представителни изображения на три биологични повторения от всяка група.E Поточна цитометрия RuDA-NPs (50 µM) или RuDA (50 µM) анализ на лечение със или без 808 nm лазер (0,5 W cm-2) в присъствието и отсъствието на Vc (0,5 mM) за 10 минути.Показани са представителни изображения на три биологични повторения от всяка група.F Nrf-2, HSP70 и HO-1 от MDA-MB-231 клетки, третирани с RuDA-NPs (50 µM) със или без 808 nm лазерно облъчване (0,5 W cm-2, 10 минути, 300 J cm-2), клетките експресират 2).Показани са представителни изображения на две биологични повторения от всяка група.
Вътреклетъчното производство на ROS в MDA-MB-231 клетки се изследва с помощта на метода на оцветяване с 2,7-дихлородихидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA).Както е показано на фиг.6D, клетките, третирани с RuDA-NPs или RuDA, показват отчетлива зелена флуоресценция, когато са облъчени с 808 nm лазер, което показва, че RuDA-NPs и RuDA имат ефективна способност да генерират ROS.Напротив, при липса на светлина или в присъствието на Vc се наблюдава само слаб флуоресцентен сигнал на клетките, което показва леко образуване на ROS.Вътреклетъчните нива на ROS в RuDA-NP клетки и третирани с RuDA MDA-MB-231 клетки бяха допълнително определени чрез поточна цитометрия.Както е показано на допълнителна фигура 25, средният интензитет на флуоресценция (MFI), генериран от RuDA-NPs и RuDA при 808 nm лазерно облъчване, е значително увеличен съответно с около 5,1 и 4,8 пъти в сравнение с контролната група, потвърждавайки тяхното отлично образуване AFK.капацитет.Въпреки това, вътреклетъчните нива на ROS в RuDA-NP или MDA-MB-231 клетки, третирани с RuDA, са сравними само с контролите без лазерно облъчване или в присъствието на Vc, подобно на резултатите от конфокален флуоресцентен анализ.
Показано е, че митохондриите са основната мишена на Ru(II)-аренови комплекси60.Следователно беше изследвана субклетъчната локализация на RuDA и RuDA-NPs.Както е показано на допълнителна фигура 26, RuDA и RuDA-NP показват подобни профили на клетъчно разпределение с най-високо натрупване в митохондриите (съответно 62,5 ± 4,3 и 60,4 ± 3,6 ng/mg протеин).Въпреки това, само малко количество Ru беше открито в ядрените фракции на Ore и NP Ore (3,5 и 2,1%, съответно).Останалата клетъчна фракция съдържа остатъчен рутений: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg протеин) за RuDA и 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg протеин) за RuDA-NPs.Като цяло Ore и NP Ore се натрупват главно в митохондриите.За да оценим митохондриалната дисфункция, използвахме JC-1 и MitoSOX Red оцветяване, за да оценим съответно потенциала на митохондриалната мембрана и капацитета за производство на супероксид.Както е показано на допълнителна фигура 27, интензивна зелена (JC-1) и червена (MitoSOX Red) флуоресценция се наблюдава в клетки, третирани както с RuDA, така и с RuDA-NPs при 808 nm лазерно облъчване, което показва, че както RuDA, така и RuDA-NPs са силно флуоресцентни Може ефективно да индуцира деполяризация на митохондриалната мембрана и производство на супероксид.В допълнение, механизмът на клетъчна смърт беше определен с помощта на базиран на поточна цитометрия анализ на анексин V-FITC/пропидиев йодид (PI).Както е показано на фигура 6E, когато са облъчени с 808 nm лазер, RuDA и RuDA-NP индуцират значително повишена скорост на ранна апоптоза (долния десен квадрант) в MDA-MB-231 клетки в сравнение с PBS или PBS плюс лазер.обработени клетки.Въпреки това, когато беше добавен Vc, степента на апоптоза на RuDA и RuDA-NP намалява значително от 50.9% и 52.0% до 15.8% и 17.8%, съответно, което потвърждава важната роля на ROS във фотоцитотоксичността на RuDA и RuDA-NP..В допълнение, леки некротични клетки бяха наблюдавани във всички тествани групи (горен ляв квадрант), което предполага, че апоптозата може да бъде преобладаващата форма на клетъчна смърт, предизвикана от RuDA и RuDA-NPs.
Тъй като увреждането от оксидативен стрес е основен фактор, определящ апоптозата, ядреният фактор, свързан с еритроид 2, фактор 2 (Nrf2) 62, ключов регулатор на антиоксидантната система, беше изследван в MDA-MB-231, третиран с RuDA-NPs.Механизъм на действие на RuDA NPs, индуциран от облъчване.В същото време беше открита и експресия на низходящия протеин хем оксигеназа 1 (HO-1).Както е показано на Фигура 6F и Допълнителна Фигура 29, RuDA-NP-медиираната фототерапия повишава нивата на експресия на Nrf2 и HO-1 в сравнение с PBS групата, което показва, че RuDA-NPs могат да стимулират сигналните пътища за оксидативен стрес.В допълнение, за изследване на фототермичния ефект на RuDA-NPs63, експресията на протеина на топлинен шок Hsp70 също беше оценена.Ясно е, че клетките, третирани с RuDA-NPs + 808 nm лазерно облъчване, показват повишена експресия на Hsp70 в сравнение с другите две групи, отразявайки клетъчен отговор на хипертермия.
Забележителните in vitro резултати ни подтикнаха да изследваме in vivo ефективността на RuDA-NP при голи мишки с MDA-MB-231 тумори.Тъканното разпределение на RuDA NPs е изследвано чрез определяне на съдържанието на рутений в черния дроб, сърцето, далака, бъбреците, белите дробове и туморите.Както е показано на фиг.7А, максималното съдържание на Ore NPs в нормалните органи се появява при първото време на наблюдение (4 часа), докато максималното съдържание се определя в туморните тъкани 8 часа след инжектирането, вероятно поради Ore NPs.EPR ефект на LF.Според резултатите от разпределението, оптималната продължителност на лечението с NP руда е взета 8 часа след приложението.За да се илюстрира процесът на натрупване на RuDA-NPs в туморните места, фотоакустичните (PA) свойства на RuDA-NPs бяха наблюдавани чрез записване на PA сигналите на RuDA-NPs в различно време след инжектирането.Първо, PA сигналът на RuDA-NP in vivo беше оценен чрез записване на PA изображения на туморно място след интратуморно инжектиране на RuDA-NP.Както е показано на допълнителна фигура 30, RuDA-NPs показаха силен PA сигнал и имаше положителна корелация между концентрацията на RuDA-NP и интензитета на PA сигнала (допълнителна фигура 30A).След това, in vivo PA изображения на туморни места бяха записани след интравенозно инжектиране на RuDA и RuDA-NP в различни времеви точки след инжектирането.Както е показано на Фигура 7В, PA сигналът на RuDA-NPs от мястото на тумора постепенно се увеличава с времето и достига плато на 8 часа след инжектирането, в съответствие с резултатите от тъканното разпределение, определени чрез ICP-MS анализ.По отношение на RuDA (допълнителна фигура 30B), максималният интензитет на PA сигнала се появява 4 часа след инжектирането, което показва бърза скорост на навлизане на RuDA в тумора.В допълнение, екскреторното поведение на RuDA и RuDA-NPs беше изследвано чрез определяне на количеството рутений в урината и изпражненията с помощта на ICP-MS.Основният път на елиминиране на RuDA (допълнителна фигура 31) и RuDA-NPs (фиг. 7C) е чрез изпражненията и е наблюдаван ефективен клирънс на RuDA и RuDA-NPs по време на 8-дневния период на изследване, което означава, че RuDA и RuDA-NP могат ефективно да се елиминират от тялото без дългосрочна токсичност.
A. Ex vivo разпределението на RuDA-NP в миши тъкани се определя от съдържанието на Ru (процент на приложената доза Ru (ID) на грам тъкан) в различни моменти след инжектирането.Данните са средно ± стандартно отклонение (n = 3). Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарни двустранни t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарни двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.B PA изображения на in vivo туморни места при 808 nm възбуждане след интравенозно приложение на RuDA-NP (10 µmol kg-1) в различни времеви точки.След интравенозно приложение на RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru се екскретира от мишки с урина и изпражнения на различни интервали от време.Данните са средно ± стандартно отклонение (n = 3).
Капацитетът на нагряване на RuDA-NP in vivo е изследван при голи мишки с MDA-MB-231 и RuDA тумори за сравнение.Както е показано на фиг.8A и допълнителна фигура 32, контролната (физиологичен разтвор) група показва по-малка промяна на температурата (ΔT ≈ 3 °C) след 10 минути непрекъснато излагане.Въпреки това, температурата на RuDA-NPs и RuDA се повишава бързо с максимални температури съответно от 55, 2 и 49, 9 ° C, осигурявайки достатъчна хипертермия за in vivo терапия на рак.Наблюдаваното повишаване на високата температура за RuDA NP (ΔT ≈ 24 ° C) в сравнение с RuDA (ΔT ≈ 19 ° C) може да се дължи на по-добрата му пропускливост и натрупване в туморните тъкани поради EPR ефекта.
Инфрачервени термични изображения на мишки с MDA-MB-231 тумори, облъчени с 808 nm лазер в различно време 8 часа след инжектирането.Показани са представителни изображения на четири биологични повторения от всяка група.B Относителен обем на тумора и C Средна туморна маса на различни групи мишки по време на лечението.D Криви на телесното тегло на различни групи мишки.Облъчва се с лазер с дължина на вълната 808 nm с мощност 0,5 W/cm2 за 10 минути (300 J/cm2).Ленти за грешки, средна стойност ± стандартно отклонение (n = 3). Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени, двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарни двустранни t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарни двустранни t-тестове *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Несдвоени двустранни t-тестове *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. E H&E оцветяващи изображения на основни органи и тумори от различни групи за лечение, включително физиологичен разтвор, физиологичен разтвор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазерни групи. E H&E оцветяващи изображения на основни органи и тумори от различни групи за лечение, включително физиологичен разтвор, физиологичен разтвор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазерни групи. Изображения на окрашвания E H&E на основните и опухолей органи от различни групи лечения, включително групи физиологични разтвори, физиологични разтвори + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E оцветени изображения на основни органи и тумори от различни групи за лечение, включително физиологичен разтвор, физиологичен разтвор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазерни групи.来自 不同 治疗 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 的 E H&E 染色 图像 ， 包括 盐水 盐水 、 水 + 激光 、 RUDA 、 RUDA + 激光 、 RUDA-NPS 和 RUDA-NPS + 激光组。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Украсяване E H&E на основните органи и опухолей от различни групи лечения, включително физиологичен разтвор, физиологичен разтвор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. E H&E оцветяване на основни органи и тумори от различни групи за лечение, включително физиологичен разтвор, физиологичен разтвор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер.Скала: 60 ​​µm.
Ефектът от фототерапията in vivo с RuDA и RuDA NPs беше оценен, при което голи мишки с MDA-MB-231 тумори бяха инжектирани интравенозно с RuDA или RuDA NPs при единична доза от 10,0 µmol kg-1 през опашната вена и след това 8 часа след инжектирането.лазерно облъчване с дължина на вълната 808 nm.Както е показано на Фигура 8В, туморните обеми са значително увеличени в групите с физиологичен разтвор и лазер, което показва, че облъчването с физиологичен разтвор или лазер 808 има малък ефект върху туморния растеж.Както в групата с физиологичен разтвор, бърз растеж на тумора също се наблюдава при мишки, третирани с RuDA-NPs или RuDA в отсъствието на лазерно облъчване, демонстрирайки тяхната ниска токсичност на тъмнината.За разлика от това, след лазерно облъчване, както лечението с RuDA-NP, така и с RuDA индуцира значителна регресия на тумора с намаляване на обема на тумора от 95,2% и 84,3%, съответно, в сравнение с групата, лекувана с физиологичен разтвор, което показва отлична синергична PDT., медииран от RuDA/CHTV ефекта.– NP или Ore. В сравнение с RuDA, RuDA NPs показват по-добър фототерапевтичен ефект, което се дължи главно на EPR ефекта на RuDA NPs.Резултатите от инхибирането на туморния растеж бяха допълнително оценени чрез теглото на тумора, изрязано на 15-ия ден от лечението (Фигура 8C и Допълнителна фигура 33).Средната туморна маса при мишки, третирани с RuDA-NP и мишки, третирани с RuDA, е съответно 0,08 и 0,27 g, което е много по-леко, отколкото в контролната група (1,43 g).
В допълнение, телесното тегло на мишки се записва на всеки три дни, за да се изследва тъмната токсичност на RuDA-NPs или RuDA in vivo.Както е показано на Фигура 8D, не са наблюдавани значими разлики в телесното тегло за всички третирани групи. Освен това, беше предприето оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на основните органи (сърце, черен дроб, далак, бял дроб и бъбрек) от различни групи на лечение. Освен това беше извършено оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на основните органи (сърце, черен дроб, далак, бял дроб и бъбрек) от различни групи на лечение. Освен това, беше проведено окрашване с гематоксилин и еозином (H&E) на основните органи (сърца, печени, селезенки, леки и почки) от различни групи лечение. Освен това беше извършено оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) на основните органи (сърце, черен дроб, далак, бели дробове и бъбреци) от различни групи на лечение.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (ТОЙ) Освен това, провеждали окрашване с гематоксилин и еозином (H&E) на основните органи (сърца, печени, селезенки, леки и почек) в различни групи от лечение. В допълнение, оцветяването с хематоксилин и еозин (H&E) на основните органи (сърце, черен дроб, далак, бял дроб и бъбрек) е извършено в различни групи на лечение.Както е показано на фиг.8E, H&E оцветените изображения на пет основни органа от групите RuDA-NPs и RuDA не показват очевидни аномалии или увреждания на органи. 8E, H&E оцветените изображения на пет основни органа от групите RuDA-NPs и RuDA не показват очевидни аномалии или увреждания на органи.Както е показано на фиг.8E, изображенията на закръшването на H&E на пет основни органа от група RuDA-NPs и RuDA не демонстрират явни аномалии или увредени органи. 8E, H&E оцветени изображения на пет основни органа от групите RuDA-NPs и RuDA не показват очевидни органни аномалии или лезии.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官イ如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Както е показано на фигура 8E, изображенията на закръшването на H&E на пет основни органа от група RuDA-NPs и RuDA не показват явни аномалии или увреждания. Както е показано на Фигура 8E, H&E оцветените изображения на петте основни органа от групите RuDA-NPs и RuDA не показват очевидни аномалии или увреждане на органи.Тези резултати показват, че нито RuDA-NP, нито RuDA показват признаци на токсичност in vivo. Нещо повече, H&E оцветените изображения на тумори показаха, че и двете групи RuDA + Laser и RuDA-NPs + Laser могат да причинят тежко унищожаване на ракови клетки, демонстрирайки отличната in vivo фототерапевтична ефикасност на RuDA и RuDA-NPs. Нещо повече, H&E оцветените изображения на тумори показаха, че и двете групи RuDA + Laser и RuDA-NPs + Laser могат да причинят тежко унищожаване на ракови клетки, демонстрирайки отличната in vivo фототерапевтична ефикасност на RuDA и RuDA-NPs.В допълнение, оцветените с хематоксилин-еозин туморни изображения показват, че както RuDA+Laser, така и RuDA-NPs+Laser групите могат да индуцират тежко унищожаване на ракови клетки, демонстрирайки превъзходната фототерапевтична ефикасност на RuDA и RuDA-NPs in vivo.此外，肿瘤的H&E 染色图像显示，RuDA + Laser 和RuDA-NPs + Laser 组均可导致严重的癌细胞破坏，证明了RuDA 和RuDA-NPs 的优异的体内光疗功效。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 显示 ， ， RUDA + лазер 和 ruda-nps + лазер 组均 导致 的 癌 癌 破坏 破坏 证明 了 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 .....В допълнение, изображения на тумори, оцветени с хематоксилин и еозин, показват, че както RuDA+Laser, така и RuDA-NPs+Laser групите водят до тежко унищожаване на ракови клетки, демонстрирайки превъзходна фототерапевтична ефикасност на RuDA и RuDA-NPs in vivo.
В заключение, Ru (II) -арен (RuDA) органометален комплекс с DA-тип лиганди е проектиран да улесни ISC процеса, използвайки метода на агрегиране.Синтезираният RuDA може да се самосглобява чрез нековалентни взаимодействия, за да образува супрамолекулни системи, получени от RuDA, като по този начин улеснява образуването на 1O2 и ефективното фототермално преобразуване за индуцирана от светлина терапия на рак.Трябва да се отбележи, че мономерният RuDA не генерира 1O2 при лазерно облъчване при 808 nm, но може да генерира голямо количество 1O2 в агрегирано състояние, демонстрирайки рационалността и ефективността на нашия дизайн.Последващите проучвания показват, че супрамолекулният монтаж дава на RuDA подобрени фотофизични и фотохимични свойства, като абсорбция на червено отместване и устойчивост на фотоизбелване, които са силно желани за PDT и PTT обработка.Както in vitro, така и in vivo експериментите показват, че RuDA NP с добра биосъвместимост и добро натрупване в тумора проявяват отлична светлинно индуцирана противоракова активност при лазерно облъчване при дължина на вълната 808 nm.По този начин RuDA NPs като ефективни бимодални супрамолекулни PDT/PTW реагенти ще обогатят набора от фотосенсибилизатори, активирани при дължини на вълните над 800 nm.Концептуалният дизайн на супрамолекулната система осигурява ефективен път за NIR-активирани фотосенсибилизатори с отлични фотосенсибилизиращи ефекти.
Всички химикали и разтворители са получени от търговски доставчици и са използвани без допълнително пречистване.RuCl3 е закупен от Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, Китай).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-фенантролин-5,6-дион) и 4,7-бис[4-(N,N-дифениламино)фенил]-5 ,6-Диамино-2,1,3-бензотиадиазолът е синтезиран съгласно предишни проучвания64,65.NMR спектрите бяха записани на спектрометър Bruker Avance III-HD 600 MHz в аналитичния тестов център на Югоизточния университет, използвайки d6-DMSO или CDCI3 като разтворител.Химичните отмествания δ са дадени в ppm.по отношение на тетраметилсилан, а константите на взаимодействие J са дадени в абсолютни стойности в херца.Масспектрометрия с висока разделителна способност (HRMS) се извършва на Agilent 6224 ESI/TOF MS инструмент.Елементният анализ на С, Н и N беше извършен на елементен анализатор Vario MICROCHNOS (Elementar).UV-видимите спектри бяха измерени на Shimadzu UV3600 спектрофотометър.Флуоресцентните спектри бяха записани на Shimadzu RF-6000 спектрофлуориметър.EPR спектрите бяха записани на Bruker EMXmicro-6/1 инструмент.Морфологията и структурата на подготвените проби са изследвани на инструменти FEI Tecnai G20 (TEM) и Bruker Icon (AFM), работещи при напрежение 200 kV.Динамичното разсейване на светлината (DLS) се извършва на анализатор Nanobrook Omni (Brookhaven).Фотоелектрохимичните свойства бяха измерени на електрохимична настройка (CHI-660, Китай).Фотоакустичните изображения са получени с помощта на системата FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Конфокални изображения бяха получени с помощта на конфокален микроскоп Olympus FV3000.FACS анализът беше извършен на BD Calibur поточен цитометър.Експериментите с високоефективна течна хроматография (HPLC) бяха проведени на система Waters Alliance e2695, използвайки 2489 UV/Vis детектор.Тестовете за гел проникваща хроматография (GPC) бяха записани на инструмент Thermo ULTIMATE 3000, използвайки ERC RefratoMax520 детектор за индекс на пречупване.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-фенантролин-5,6-дион)64 (481.0 mg, 1.0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-дифениламино)фенил]-5,6-диамино-2,1,3-бензотиадиазол 65 (652.0 mg, 1.0 mmol) и ледена оцетна киселина (30 mL) се разбъркват при кипене в хладилник в продължение на 12 часа.Разтворителят след това се отстранява във вакуум с помощта на ротационен изпарител.Полученият остатък се пречиства чрез флаш колонна хроматография (силикагел, CH2CI2:MeOH=20:1), за да се получи RuDA като зелен прах (добив: 877.5 mg, 80%).анус.Изчислено за C64H48Cl2N8RuS: С 67.84, Н 4.27, N 9.89.Намерено: С 67.92, Н 4.26, N 9.82.1Н NMR (600 MHz, d6-DMSO) делта 10.04 (s, 2Н), 8.98 (s, 2Н), 8.15 (s, 2Н), 7.79 (s, 4Н), 7.44 (s, 8Н), 7.21 (d, J = 31.2 Hz, 16H), 6.47 (s, 2H), 6.24 (s, 2H), 2.69 (s, 1H), 2.25 (s, 3H), 0.99 (s, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 1097.25.
Синтез на 4,7-бис[4-(N,N-диетиламино)фенил-5,6-диамино-2,1,3-бензотиадиазол (L2): L2 се синтезира в два етапа.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0.040 mmol) се добавя към N,N-диетил-4-(трибутилстанил)анилин (1.05 g, 2.4 mmol) и 4,7-дибромо-5,6-динитро разтвор - 2, 1,3-бензотиадиазол (0.38 g, 1.0 mmol) в сух толуен (100 ml).Сместа се разбърква при 100°С в продължение на 24 часа.След отстраняване на толуена във вакуум, полученото твърдо вещество се промива с петролев етер.След това смес от това съединение (234.0 mg, 0.45 mmol) и железен прах (0.30 g, 5.4 mmol) в оцетна киселина (20 ml) се разбърква при 80°С в продължение на 4 часа.Реакционната смес се излива във вода и полученото кафяво твърдо вещество се събира чрез филтруване.Продуктът се пречиства два пъти чрез сублимация под вакуум до получаване на зелено твърдо вещество (126.2 mg, 57% добив).анус.Изчислено за C26H32N6S: С 67.79, Н 7.00, N 18.24.Намерено: С 67.84, Н 6.95, Н 18.16.'Н NMR (600 MHz, CDC13), 5 (ppm) 7.42 (d, 4Н), 6.84 (d, 4Н), 4.09 (s, 4Н), 3.42 (d, 8Н), 1.22 (s, 12Н).13С NMR (150 MHz, CDC13), 5 (ppm) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [М+Н]+ = 461.24.
Съединенията се приготвят и пречистват, като се следват процедури, подобни на RuDA.анус.Изчислено за C48H48Cl2N8RuS: С 61.27, Н 5.14, N 11.91.Намерено: С, 61.32, Н, 5.12, N, 11.81, 1Н NMR (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10.19 (s, 2Н), 9.28 (s, 2Н), 8.09 (s, 2Н), 7,95 (s, 4Н), 6,93 (s, 4Н), 6,48 (d, 2Н), 6,34 (s, 2Н), 3,54 (t, 8Н), 2,80 (m, 1Н), 2,33 (s, ЗН), 1,31 (t, 12H), 1.07 (s, 6H).13c nmr (151 mhz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0, 84.4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 905.24.
RuDA се разтваря в MeOH/H2O (5/95, v/v) при концентрация от 10 μM.Абсорбционният спектър на RuDA се измерва на всеки 5 минути на спектрофотометър Shimadzu UV-3600 при облъчване с лазерна светлина с дължина на вълната 808 nm (0,5 W/cm2).ICG спектрите бяха записани при същите условия като стандарта.
EPR спектрите са записани на спектрометър Bruker EMXmicro-6/1 с микровълнова мощност 20 mW, обхват на сканиране 100 G и модулация на полето 1 G. 2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидон (TEMP) и 5,5-диметил-1-пиролин N-оксид (DMPO) бяха използвани като спинови капани.Спектрите на електронен спинов резонанс бяха записани за смесени разтвори на RuDA (50 µM) и TEMF (20 mM) или DMPO (20 mM) под действието на лазерно лъчение с дължина на вълната 808 nm (0.5 W/cm2).
Изчисленията на DFT и TD-DFT за RuDA бяха извършени при нива на PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ във воден разтвор, като се използва програмата на Гаус 1666,67,68.Разпределенията на HOMO-LUMO, дупките и електроните на нискоенергийното синглетно възбудено състояние RuDA бяха начертани с помощта на програмата GaussView (версия 5.0).
Първо се опитахме да измерим ефективността на генериране на 1O2 RuDA, използвайки конвенционална UV-видима спектроскопия с ICG (ΦΔ = 0,002) като стандарт, но фотодеградацията на ICG силно повлия на резултатите.По този начин квантовият добив на 1O2 RuDA беше измерен чрез откриване на промяна в интензитета на флуоресценцията на ABDA при около 428 nm, когато се облъчи с лазер с дължина на вълната 808 nm (0,5 W/cm2).Бяха проведени експерименти с RuDA и RuDA NP (20 μM) във вода/DMF (98/2, v/v), съдържащи ABDA (50 μM).Квантовият добив на 1O2 се изчислява по следната формула: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS и rICG са скоростите на реакция на ABDA с 1O2, получени съответно от фотосенсибилизатора и ICG.APS и AICG са абсорбцията на фотосенсибилизатора и ICG съответно при 808 nm.
AFM измерванията бяха извършени в течни условия, като се използва режим на сканиране на Bruker Dimension Icon AFM система.Използвайки отворена структура с течни клетки, клетките се промиват два пъти с етанол и се сушат с поток от азот.Поставете изсушените клетки в оптичната глава на микроскопа.Незабавно поставете капка от пробата в басейна с течност и я поставете върху конзолата с помощта на стерилна пластмасова спринцовка за еднократна употреба и стерилна игла.Друга капка се поставя директно върху пробата и когато оптичната глава се спусне, двете капки се сливат, образувайки менискус между пробата и резервоара с течност.AFM измерванията бяха извършени с помощта на SCANASYST-FLUID V-образна нитридна конзола (Bruker, твърдост k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
HPLC хроматограми бяха получени на система Waters e2695, оборудвана с колона phoenix C18 (250 × 4.6 mm, 5 µm), използвайки 2489 UV/Vis детектор.Дължината на вълната на детектора е 650 nm.Подвижните фази А и В са вода и метанол, съответно, и скоростта на потока на подвижната фаза е 1.0 ml·min-1.Градиентът (разтворител В) е както следва: 100% от 0 до 4 минути, 100% до 50% от 5 до 30 минути и нулиране на 100% от 31 до 40 минути.Рудата се разтваря в смесен разтвор на метанол и вода (50/50, по обем) при концентрация от 50 μM.Инжекционният обем беше 20 μl.
GPC анализите бяха записани на Thermo ULTIMATE 3000 инструмент, оборудван с две PL aquagel-OH MIXED-H колони (2×300×7.5 mm, 8 µm) и ERC RefratoMax520 детектор за индекс на пречупване.GPC колоната се елуира с вода при скорост на потока от 1 ml/min при 30°С.Рудните NPs се разтварят в разтвор на PBS (рН = 7.4, 50 μM), инжекционният обем е 20 μL.
Фототоковете бяха измерени на електрохимична настройка (CHI-660B, Китай).Оптоелектронните реакции при включване и изключване на лазера (808 nm, 0,5 W/cm2) бяха измерени съответно при напрежение 0,5 V в черна кутия.Използва се стандартна триелектродна клетка с L-образен стъкловъглероден електрод (GCE) като работен електрод, стандартен каломелов електрод (SCE) като референтен електрод и платинен диск като противоелектрод.Като електролит се използва 0,1 М разтвор на Na2SO4.
Клетъчната линия на човешки рак на гърдата MDA-MB-231 е закупена от KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, Китай, каталожен номер: KG033).Клетките се отглеждат в монослоеве в модифицирана на Dulbecco среда на Eagle (DMEM, висока глюкоза), допълнена с разтвор от 10% фетален говежди серум (FBS), пеницилин (100 μg/ml) и стрептомицин (100 μg/ml).Всички клетки се култивират при 37°C във влажна атмосфера, съдържаща 5% CO2.
МТТ анализът се използва за определяне на цитотоксичността на RuDA и RuDA-NPs в присъствието и отсъствието на светлинно облъчване, със или без Vc (0.5 mM).Раковите клетки MDA-MB-231 се отглеждат в 96-ямкови плаки при клетъчна плътност от приблизително 1 х 105 клетки/ml/ямка и се инкубират в продължение на 12 часа при 37.0°C в атмосфера от 5% CO2 и 95% въздух.RuDA и RuDA NPs, разтворени във вода, се добавят към клетките.След 12 часа инкубация, клетките се излагат на 0,5 W cm-2 лазерно лъчение при дължина на вълната 808 nm за 10 минути (300 J cm-2) и след това се инкубират на тъмно за 24 часа.След това клетките се инкубират с МТТ (5 mg/ml) за още 5 часа.Накрая променете средата на DMSO (200 µl), за да разтворите получените лилави формазанови кристали.Стойностите на OD бяха измерени с помощта на четец на микроплаки с дължина на вълната 570/630 nm.Стойността IC50 за всяка проба се изчислява с помощта на софтуера SPSS от кривите доза-отговор, получени от поне три независими експеримента.
MDA-MB-231 клетки бяха третирани с RuDA и RuDA-NP при концентрация от 50 μM.След 12 часа инкубация клетките се облъчват с лазер с дължина на вълната 808 nm и мощност 0,5 W/cm2 за 10 min (300 J/cm2).В групата с витамин С (Vc) клетките бяха третирани с 0,5 mM Vc преди лазерно облъчване.След това клетките се инкубират на тъмно за още 24 часа, след това се оцветяват с калцеин AM и пропидиев йодид (20 μg/ml, 5 μl) за 30 минути, след което се промиват с PBS (10 μl, рН 7.4).изображения на оцветени клетки.