Новини

Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Раковите клетки са развили различни механизми за преодоляване на клетъчния стрес и продължаване на развитието.Протеин киназа R (PKR) и нейният протеинов активатор (PACT) са първоначалните реагиращи, които наблюдават различни стресови сигнали, водещи до инхибиране на клетъчната пролиферация и апоптоза.Въпреки това, регулирането на PACT-PKR пътя в раковите клетки остава до голяма степен неизвестно.Тук открихме, че дългата некодираща РНК (lncRNA) аспартил tRNA синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) е пряко включена в инхибирането на PACT-PKR пътя и насърчава пролиферацията на ракови клетки.Използвайки широкомащабен функционален скрининг на CRISPRi 971 свързана с рак lncRNA, ние открихме, че DARS-AS1 е свързан със значително повишена пролиферация на ракови клетки.Следователно нокаутът на DARS-AS1 инхибира клетъчната пролиферация и насърчава апоптозата на раковите клетки в различни ракови клетъчни линии in vitro и значително намалява туморния растеж in vivo.Механично, DARS-AS1 се свързва директно с PACT активиращия домен и предотвратява PACT-PKR взаимодействието, като по този начин намалява PKR активирането, eIF2α фосфорилирането и инхибира апоптотичната клетъчна смърт.Клинично, DARS-AS1 е широко експресиран при множество ракови заболявания и свръхекспресията на тази lncRNA е показателна за лоша прогноза.Това проучване изяснява специфичната за рака регулация на PACT-PKR пътя от DARS-AS1 lncRNA и осигурява друга цел за прогноза и лечение на рак.
Способността за адаптиране към стреса е важна характеристика на оцеляването и пролиферацията на раковите клетки.Бързата пролиферация и метаболитните отличителни белези на рака достигат своя връх в сурови микросреди – лишаване от хранителни вещества, хипоксия и ниско рН – което може да предизвика сигнални пътища за клетъчна смърт.Нарушаването на регулацията на чувствителни към стрес гени като p535, протеини на топлинен шок 6, 7, KRAS8, 9 и HIF-110, 11, 12, 13 често се наблюдава при рак, като по този начин блокира апоптозата и насърчава оцеляването.
Протеин киназа R (PKR) е важен сензор за стрес и субединица киназа на еукариотен инициационен фактор 2α (eIF2α), транслационен регулатор, който свързва клетъчния стрес с клетъчната смърт.PKR първоначално е идентифициран като антивирусен протеин чрез откриване на чужда двойноверижна РНК (dsRNA).При активиране, PKR фосфорилира eIF2α, за да инхибира синтеза на вирусен и клетъчен протеин14,15,16.PACT (PKR активаторен протеин) е идентифициран като първият PKR активаторен протеин в отсъствието на dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Чрез директно взаимодействие с PKR, PACT преобразува различни стресове (серумно гладуване, лечение с пероксид или арсенит) към PKR и низходящите сигнални пътища.В допълнение към eIF2α фосфорилирането, PACT-медиираното PKR активиране предизвиква различни събития, свързани с отговора на стреса, включително променен редокс статус чрез PI3K/Akt24 пътя, подобрена проверка на увреждане на ДНК чрез p5325, 26 и NF-κB27, 28 Регулира транскрипцията, 29. Като се има предвид тяхната критична роля в отговора на стреса, пролиферацията, апоптозата и други ключови клетъчни процеси, PKR и PACT са обещаващи терапевтични цели за много заболявания, особено рак 30, 31, 32, 33.Въпреки това, въпреки това плейотропно функционално и биологично значение, регулирането на активността на PACT / PKR в раковите клетки остава неуловимо.
lncRNAs са транскрипти, по-големи от 200 нуклеотида без потенциал за кодиране на протеини.Тъй като авангардни проекти за секвениране на целия геном са идентифицирали хиляди lncRNA,35,36 са положени много усилия за изясняване на техните биологични функции.Все повече изследвания показват, че lncRNAs участват в много биологични процеси37, включително регулирането на инактивирането на Х-хромозомата38,39, отпечатването40, транскрипцията41,42, транслацията43 и дори растежа на рака44,45,46,47.Тези проучвания съобщават, че много lncRNA участват в PACT/PKR пътя.Едно такова проучване показа, че lncRNA ASPACT инхибира PACT транскрипцията и увеличава ядреното задържане на PACT иРНК.Други проучвания показват, че lncRNA nc886 се свързва с PKR и инхибира неговото фосфорилиране49,50.Досега не е докладвано lncRNA, регулиращо PACT-медиирано PKR активиране.
Аспартил-тРНК синтетаза антисенс РНК 1 (DARS-AS1) е идентифицирана като онкогенна lncRNA51,52,53,54.Чрез регулирането на miP-194-5p53, miP-12952 и miP-532-3p51 е доказано, че DARS-AS1 насърчава растежа съответно на ясноклетъчен бъбречноклетъчен карцином, карцином на щитовидната жлеза и недребноклетъчен белодробен карцином.Tong и колегите му също откриха, че DARS-AS1 насърчава прогресията на миелома чрез поддържане на стабилността на протеин 39 (RBM39) РНК-свързващ мотив.Въпреки това, не са провеждани проучвания за това дали тази lncRNA участва в регулирането на PACT-PKR активирането и реакцията на стрес на раковите клетки.
Тук извършихме широкомащабен екран за загуба на функция, използвайки системата CRISPRi и установихме, че DARS-AS1 lncRNA насърчава пролиферацията на няколко вида ракови клетки.В допълнение, ние идентифицирахме основен механизъм: DARS-AS1 се свързва директно с PACT, инхибира PACT и PKR свързването, предотвратява фосфорилирането на eIF2α, по-нисък PKR субстрат, и в крайна сметка инхибира апоптотичната клетъчна смърт.В заключение, нашата работа разкрива DARS-AS1 lncRNA като регулатор на PACT-PKR пътя и потенциална цел за лечение и прогноза на рак.
Обширни проучвания за геномно профилиране са идентифицирали стотици lncRNA, свързани с рак.Въпреки това тяхната функция остава до голяма степен неизвестна56.За да идентифицираме обещаващи кандидати за lncRNA, участващи в прогресията на рака, ние извършихме екран за загуба на функция за намалена пролиферация в клетъчната линия на колоректален рак SW620, използвайки системата CRISPRi (Фиг. 1а).Уникалната характеристика на клетъчните линии на рак на дебелото черво SW480 и SW620 е, че те са получени от първични и вторични тумори на един пациент.Това осигурява ценно сравнение за изучаване на генетични промени в прогресията на напреднал рак на дебелото черво.Следователно, ние анализирахме транскриптомите на клетъчни линии на колоректален рак (SW480 и SW620), използвайки РНК секвениране и събрахме някои потенциални функционални lncRNA от публикуваната литература.Въз основа на тези резултати, ние проектирахме сборна sgRNA библиотека, съдържаща 7355 sgRNA олиго, насочени към 971 свързани с рак lncRNA и 500 ненасочени sgRNA олиго за отрицателна контрола (допълнителни данни 1).
Схематично представяне на скрининг с помощта на системата CRISPRi.b sgRNA обогатяване след скрининг.Хоризонталната пунктирана линия представлява log2 (промяна на сгъване) = ±0,58.Вертикалната пунктирана линия показва p стойност = 0,05.Черните точки представляват нецелева sgRNA (означена като NC).Червените точки са sgRNA, насочени към DARS-AS1.Сините точки са sgRNA, насочени към LINC00205, описана по-рано онкогенна lncRNA.промяна на сгъването = (нормализирано отчитане, ден 17)/(нормализирано отчитане, ден 0).c Нокдаунът на DARS-AS1 sgRNA инхибира клетъчния растеж.Лентите за грешки представляват ± стандартно отклонение на трите експеримента.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 двустранен t-тест на Student.d DARS-AS1 експресия в тумори (TCGA набор от данни).em Експресия на DARS-AS1 в сдвоени нормални и туморни проби от пациенти с BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP и COAD, съответно (TCGA набор от данни).p-стойностите са получени с помощта на сдвоен двустранен t-тест на Student.
След конструирането на плазмида и опаковането на лентивируса, ние трансдуцирахме клетъчната линия на колоректален рак dCas9-SW620 с горната библиотека в четири независими експеримента с инфекция.Множеството на инфекция (MOI) за тези инфекции е 0.1–0.3, което показва, че всяка клетка може да бъде трансфектирана само с една sgRNA.След 18 дни култура in vitro, профилът на обогатяване на целевите sgRNAs намалява или се увеличава след скрининга, докато броят на нецелевите контролни олигонуклеотиди остава относително непроменен в сравнение с профила преди скрининга, което показва, че нашата цел има силно специфичен за екрана библиотека.Ориз.1б и допълнителна таблица 1). LINC00205, за който по-рано беше съобщено, че насърчава прогресията на рак на белия дроб и рак на черния дроб 58, 59, 60, беше отсеян (log2 (промяна на пъти) <-0, 58, p стойност < 0, 05), потвърждавайки надеждността на този скрининг (Фиг. 1b). LINC00205, за който по-рано беше съобщено, че насърчава прогресията на рак на белия дроб и рак на черния дроб 58, 59, 60, беше отсеян (log2 (промяна на пъти) <-0, 58, p стойност < 0, 05), потвърждавайки надеждността на този скрининг (Фиг. 1b). LINC00205, за което по-рано беше съобщено, че той може да прогресира рак на леки и рак печени58, 59, 60, е изключен (log2 (кратно изменение) <-0,58, значение p <0,05), което потвърждава надеждността на този скрининг (рис 1б). LINC00205, за който по-рано беше съобщено, че насърчава прогресията на рак на белия дроб и рак на черния дроб 58, 59, 60, беше изключен (log2 (кратна промяна) <-0,58, p-стойност <0,05), потвърждавайки устойчивостта на този скрининг (фиг. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, за което по-рано беше съобщено, че той може да прогресира в рака на леки и печени 58, 59, 60, е изключен (log2 (кратно изменение) <-0,58, p-значение <0,05), което потвърждава надеждността на този скрининг (рис 1б). LINC00205, за който по-рано беше съобщено, че насърчава прогресията на рак на белите дробове и черния дроб 58, 59, 60, беше изключен (log2 (кратна промяна) <-0,58, p-стойност <0,05), потвърждавайки устойчивостта на този скрининг (фиг. .1b).
Сред всички тествани lncRNA, DARS-AS1 също беше скриниран, като трите сродни sgRNA олигонуклеотида бяха значително намалени след 18 дни култура, което предполага, че нокдаунът на тази lncRNA е довел до намалена пролиферация на рак (Фиг. 1b).Този резултат беше допълнително подкрепен от MTS анализ в колоректални ракови клетки, показващ, че скоростта на растеж на нокдаун клетките DARS-AS1 е намалена само наполовина в сравнение с контролните клетки (Фигура 1в) и е в съответствие с предишни доклади за няколко други вида рак.: ясноклетъчен рак на бъбреците, рак на щитовидната жлеза и недребноклетъчен рак на белия дроб51,52,53,55.Въпреки това, неговата функция и молекулярни механизми при колоректален рак остават неизследвани.Затова избрахме тази lncRNA за по-нататъшно изследване.
За да изследваме експресията на DARS-AS1 при пациенти, анализирахме изчерпателно 10 327 туморни проби от проекта Cancer Genome Atlas (TCGA).Нашите резултати показват, че DARS-AS1 е широко експресиран и значително повишен в здрави клетки в различни тумори, включително аденокарцином на дебелото черво (COAD), бъбречен светлоклетъчен карцином (KIRC) и бъбречен папиларен клетъчен карцином (KIRP)..Много малко (фиг. 1d и допълнителна фигура 1a, b). Анализът на сдвоени здрави/туморни проби допълнително потвърди значително по-висока експресия на DARS-AS1 в туморите на уротелиален карцином на пикочния мехур (BLCA), бъбречен светлоклетъчен карцином (KIRC), аденокарцином на простатата (PRAD), белодробен плоскоклетъчен карцином (LUSC) , карцином на ендометриума на корпуса на матката (UCEC), аденокарцином на белия дроб (LUAD), хепатоцелуларен карцином на черния дроб (LIHC), бъбречен папиларен клетъчен карцином (KIRP) и аденокарцином на дебелото черво (COAD) (p стойност <0,05) (фиг. 1e–m) . Анализът на сдвоени здрави/туморни проби допълнително потвърди значително по-висока експресия на DARS-AS1 в туморите на уротелиален карцином на пикочния мехур (BLCA), бъбречен светлоклетъчен карцином (KIRC), аденокарцином на простатата (PRAD), белодробен плоскоклетъчен карцином (LUSC) , карцином на ендометриума на корпуса на матката (UCEC), аденокарцином на белия дроб (LUAD), хепатоцелуларен карцином на черния дроб (LIHC), бъбречен папиларен клетъчен карцином (KIRP) и аденокарцином на дебелото черво (COAD) (p стойност <0,05) (фиг. 1e–m) .Анализът на сдвоени здрави/туморни проби също потвърди значително по-висока експресия на DARS-AS1 в уротелиален карцином на пикочния мехур (BLCA), светлоклетъчен бъбречен и бъбречноклетъчен карцином (KIRC), аденокарцином на простатата (PRAD), белодробен плоскоклетъчен карцином (LUSC) тумори., карцином на ендометрията на тялото на матката (UCEC), аденокарцином на лекото (LUAD), хепатоцелулярна карцинома на печени (LIHC), папилярно-клетъчна карцинома на почките (KIRP) и аденокарцином на дебелите черва (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– м) . , ендометриален карцином на корпуса на матката (UCEC), аденокарцином на белия дроб (LUAD), хепатоцелуларен карцином на черния дроб (LIHC), папиларен клетъчен карцином на бъбрека (KIRP) и аденокарцином на дебелото черво (COAD) (p стойност < 0,05) (фиг. 1e–m) .配对健康/肿瘤样本的分析进一步证实了DARS-AS1 在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、肾肾透明细胞癌(KIRC)、前列腺腺癌(PRAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC) 肿瘤中的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （（LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （（kirp） 和结肠腺癌 （（） （p 值<0,05）（图1e-m） .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Анализът на здрави/туморни сдвоени проби допълнително подкрепи ролята на DARS-AS1 при тумори на уротелиален карцином на пикочния мехур (BLCA), светлоклетъчен бъбречноклетъчен карцином (KIRC), аденокарцином на простатата (PRAD) и белодробен плоскоклетъчен карцином (LUSC).експресия при карцинома на тялото на матката (UCEC), аденокарцинома на лекото (LUAD), хепатоцелулярния карцином (LIHC), чесно-почечния папилярно-клетъчен карцином (KIRP) и аденокарцинома на дебелите черва (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e). -м). експресия в карцином на корпуса на матката (UCEC), белодробен аденокарцином (LUAD), хепатоцелуларен карцином (LIHC), бъбречен папиларен клетъчен карцином (KIRP) и аденокарцином на дебелото черво (COAD) (p стойност <0,05) (Фигура 1e -m).Взети заедно, тези резултати показват, че DARS-AS1 е широко и силно експресиран в различни видове рак.
Тъй като DARS-AS1 и DARS (генът, кодиращ антисенс веригата) споделят един и същ промотор и са разположени един до друг, ние проектирахме shRNA да нокаутира специфично DARS-AS1, но не и DARS (допълнителна фигура 2a, b и допълнителна таблица 2) .В допълнение към SW620, ние също използвахме три други клетъчни линии, силно експресиращи DARS-AS1, за да изследваме ефикасността и функцията на нокдаун на shRNA (допълнителна таблица 3).Нашите резултати показват, че и трите разработени shRNAs са постигнали най-малко 80% ефективност на нокдаун на DARS-AS1 с малък ефект върху количеството на DARS mRNA (допълнителна фигура 2c-f).В допълнение, ние открихме, че нокдаунът на DARS-AS1 с тези shRNA значително инхибира клетъчния растеж в клетъчни линии на колоректален рак SW620 (49,7%) и HCT116 (27,7%), клетъчна линия на рак на гърдата MBA-MD-231 (53,4%).) и HepG2 хепатомна клетъчна линия (92,7% намаление), както и способността им да образуват незакотвени сфери (средно намаление от ~50,8%, 44,6%, 40,7% и 75,7% на клетъчна линия) (Фиг. 2a, b).В SW620, резултатите от анализа за образуване на колонии допълнително потвърждават, че DARS-AS1 shRNA значително инхибира клетъчната пролиферация със средно намаление от приблизително 69,6% (фиг. 2c).
Ефект на контролната shRNA и DARS-AS1 shRNA върху клетъчната пролиферация (a) и образуването на сфероид (b) в SW620, HCT116, MBA-MD-231 и HepG2 клетки.c Ефект на контролната shRNA и DARS-AS1 shRNA върху образуването на колония в SW620 клетки.Клетъчна пролиферация (d), образуване на сфероид (e) и образуване на колония (f) на SW620 клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1.Показаните данни са средно ± стандартно отклонение от три експеримента.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 и *** p ≤ 0,001 чрез двустранен t-тест на Student.
За да допълним проучванията за загуба на функция, след това създадохме SW620 клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1 (допълнителна фигура 2g).Свръхекспресията на DARS-AS1 значително повишава клетъчния растеж (1,8 пъти), образуването на незакотвени сфероиди (1,4 пъти) и образуването на колонии (3,3 пъти) в SW620 клетки (фиг. 2d-f).Ние потвърдихме този резултат, използвайки друга клетъчна линия, експресираща DARS-AS1, A549.Тази повишена клетъчна пролиферация, дължаща се на свръхекспресия на DARS-AS1, се наблюдава допълнително в A549 клетки (допълнителна фигура 2h, i и допълнителна таблица 3).Взети заедно, тези проучвания за печалба и загуба показват, че DARS-AS1 насърчава пролиферацията на ракови клетки in vitro.
За да проучим основния механизъм, чрез който DARS-AS1 регулира клетъчната пролиферация, ние извършихме анализ на РНК, за да идентифицираме неговите потенциални протеин-свързващи партньори.Резултатите от RT-qPCR показват, че около 86, 2% от DARS-AS1 се намира в цитоплазмата на SW620 клетки (допълнителна фигура 3а).In vitro транскрибираният биотинилиран DARS-AS1 или псевдоРНК след това се инкубира с SW620 клетъчни лизати, последвано от SDS-PAGE разделяне.Последващото оцветяване със сребро показа, че отделна лента (~38 kDa) е значително обогатена в DARS-AS1 изтеглени проби, но не и във фиктивни проби от РНК или перли (Фиг. 3а).Тази лента беше идентифицирана като PKR активиращ протеин (PACT) чрез масова спектрометрия (MS) и допълнително потвърдена чрез имуноблотинг в SW620, HCT116 и HepG2 клетъчни линии (Фиг. 3a, b).Обогатяването на DARS и свързани PACT протеини - PKR и TRBP - също беше изследвано с помощта на РНК анализ чрез Western blotting (WB).Резултатите показват, че не е открито пряко взаимодействие между DARS-AS1 РНК и тези три протеина (допълнителна фигура 3b).Специфичното взаимодействие между DARS-AS1 и PACT беше допълнително потвърдено чрез анализ на РНК имунопреципитация (RIP), който показа, че DARS-AS1 е значително обогатен с анти-PACT антитела, но не и с други контролни РНК (Фигура 3с).За да се определи дали DARS-AS1 взаимодейства директно с PACT в отсъствието на други клетъчни компоненти, беше извършен in vitro анализ на интерферометрия на биослоя (BLI), използвайки пречистен PACT.Белязана с биотин DARS-AS1 или фиктивна РНК се имобилизира върху биосензори на стрептавидин (SA) и след това се инкубира в кинетичен буфер, съдържащ 1 μM PACT.По-специално, PACT се свързва силно с DARS-AS1 (стойност на KD ~ 26.9 nM), но не и да имитира РНК (Фигура 3d).Взети заедно, тези резултати демонстрират пряко взаимодействие и висок афинитет между DARS-AS1 и PACT.
Анализът на изтегляне на РНК идентифицира DARS-AS1, взаимодействащ с PACT в SW620 клетки.По-горе, оцветяване със сребро на свързани протеини.По-ниски имуноблоти бяха извършени с анти-PACT антитяло.b RNA анализ на падане беше извършен в HCT116 (отгоре) и HepG2 (отдолу) клетки.Обогатяването на PACT беше открито чрез имуноблотинг.cRNA имунопреципитационни (RIP) анализи се извършват в SW620 клетки, като се използват посочените антитела.d PACT кривите на свързване към DARS-AS1 с пълна дължина или контролна РНК бяха получени с помощта на интерферометрия на биослоя (BLI).РНК беше имобилизирана върху стрептавидинов биосензор.1 μM PACT беше използван за измерване на асоциацията.Тестът за изтегляне на РНК се извършва с помощта на биотинилиран DARS-AS1 с пълна дължина или пресечен (отгоре).Имуноблот, показващ получен PACT (отдолу).f Пречистен маркиран PACT се инкубира с биотинилиран DARS-AS1 в пълна дължина или съкратен (както в e) за in vitro RIP анализ.Екстрахираната РНК се проверява чрез RT-qPCR.g Относителният афинитет на различни РНК фрагменти за PACT беше получен с помощта на интерферометрия на биослоя.За анализ бяха използвани 100 nM RNA и 1 μM RAST.h In vitro RIP анализи бяха извършени с помощта на пречистен непокътнат или пресечен белязан PACT.Екстрахираната РНК се проверява чрез RT-qPCR.i Скорост на растеж на SW620 клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1, PACT или и двете.j Свръхекспресията на DARS-AS1 с пълна дължина или пресечен в клетки SW620 има различни ефекти върху клетъчния растеж.k Апоптозата се открива чрез имуноблотинг с анти-PARP антитяло.l Нокаутът на DARS-AS1 индуцира апоптоза на SW620 клетки, както е показано чрез поточна цитометрия.Показаните данни са средно ± стандартно отклонение от три експеримента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, чрез двустранен t тест на Student. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, чрез двустранен t тест на Student. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустранния критерий Стюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 чрез двустранен t-тест на Student. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустранния критерий Стюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 чрез двустранен t-тест на Student.
След това генерирахме три биотинилирани DARS-AS1 РНК фрагмента чрез in vitro транскрипция, за да идентифицираме DARS-AS1 региона, необходим за PACT асоцииране (Фигура 3е).Резултатите от анализа на РНК показват, че всеки фрагмент е в състояние да взаимодейства с PACT, но 3'-терминалната област (384–768 нуклеотида, белязана с A3) показва повече от 1–384 нуклеотида, белязана с A1) (Фиг. 3e).Подобни резултати са наблюдавани при in vitro RIP анализ с използване на рекомбинантен PACT (Фигура 3f).В съответствие с тези резултати, експериментите за свързване на имобилизирани РНК фрагменти към PACT с помощта на BLI също показват, че PACT има по-висок афинитет към A3 (384–768 nt) (KD стойност от приблизително 94,6 nM), докато почти няма връзки с други области.(фиг. 3d).
Ние също така изследвахме свързаните региони на свързване в PACT.PACT съдържа три функционални домена, два от които са запазени двойноверижни РНК-свързващи домени (dsRBD) и трети домейн (означен като D3), който действа като активатор на протеинови взаимодействия.За да изследваме капацитета на свързване на lncRNA на всеки домейн, ние създадохме три мутации, които премахнаха всеки от трите домена и извършихме in vitro RIP анализ.Нашите резултати показаха, че делецията на третия домейн (D3) на PACT значително намалява взаимодействието му с DARS-AS1 (с 0,11 пъти в сравнение с непокътнатия PACT) в сравнение с другите две мутации (фиг. 3h), беше показано, че освобождаването на D3 взаимодейства с DARS.-AC1.Взети заедно, тези резултати предполагат, че взаимодействието между DARS-AS1 и PACT може да възникне предимно през 3' края на DARS-AS1 и D3 домейна на PACT.
Отбелязахме, че DARS-AS1 няма ефект върху експресията на PACT и PACT няма ефект върху DARS-AS1 (допълнителна фигура 3с).След това изследвахме ефекта от PACT нокдаун върху клетъчния растеж.За разлика от DARS-AS1, относителните клетки растат 1, 5–3 пъти по-бързо, когато PACT беше съборен (допълнителна фигура 3d).Резултатите от анализа за образуване на колонии показват, че клетките образуват 2-3-кратни колонии след третиране с shRNA с PACT (допълнителна фигура 3е).За да тестваме дали DARS-AS1 регулира клетъчната пролиферация чрез PACT, ние генерирахме SW620 клетки, свръхекспресиращи PACT, DARS-AS1 или и двете.Свръхекспресията на PACT показва значително инхибиране на клетъчната пролиферация (Фигура 3i).Докато свръхекспресията на DARS-AS1 per se значително насърчава клетъчната пролиферация, няма значителна разлика в скоростта на растеж на клетките, свръхекспресиращи DARS-AS1 и PACT.Тези резултати предполагат, че PACT може да противодейства на повишената пролиферация, причинена от свръхекспресията на DARS-AS1.
Тъй като различните региони на DARS-AS1 имат различни PACT-свързващи способности, ние изследвахме тяхното относително влияние върху клетъчната пролиферация чрез различна свръхекспресия на DARS-AS1 фрагменти.В сравнение с другите два фрагмента, DARS-AS1 беше свръхекспресиран в 3' края (384–768 nt), основната свързана с PACT област в DARS-AS1, която имаше най-висока способност да стимулира клетъчната пролиферация (Фиг. 3j).Тези резултати показват положителна корелация между капацитета на свързване и биологичната функция на DARS-AS1.
Съобщава се, че PACT е проапоптотичен протеин19.Следователно, ние изследвахме ефекта на DARS-AS1 върху апоптозата.Както се очакваше, нокдаунът на DARS-AS1 значително увеличи разцепването на PARP в SW620 клетки и увеличи дела на анексин V-положителни клетки в SW620, HCT116, HepG2 и MBA-MD-231 клетъчни линии (Фиг. 3k).3).3f-h), което показва, че антиапоптотичният ефект на DARS-AS1 в раковите клетки е противоположен на индуциращата апоптоза функция на PACT.Взети заедно, тези резултати предполагат, че механизмът на онкогенната функция на DARS-AS1 може да бъде чрез инхибиране на PACT функцията.
След това проучихме функционалните последици от асоциацията DARS-AS1-PACT.Съобщава се, че PACT активира PKR чрез директно взаимодействие, което впоследствие подобрява фосфорилирането на eIF2α, причинявайки транслационна делеция и апоптоза17.Първо, ние проверихме дали DARS-AS1 влияе върху клетъчната локализация на PACT и PKR.Конфокалната флуоресцентна микроскопия показа, че PACT и PKR са силно колокализирани в SW620 клетки със среден корелационен коефициент на Pearson от 0,72.Междувременно свръхекспресията на DARS-AS1 значително намалява ко-локализацията на PACT и PKR (среден корелационен коефициент на Pearson 0,61) (Фигура 4а).За да проучим дали DARS-AS1 може да модулира PACT-PKR взаимодействието, ние проведохме ко-имунопреципитационен (co-IP) анализ с анти-PACT антитяло в SW620 клетъчни лизати.PKR е силно обогатен с анти-PACT в контролните клетки, докато възстановяването на PKR е значително намалено в лизати от клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1 (Фиг. 4b).Пречистен белязан PACT и PKR бяха използвани за in vitro тестове за свързване на протеини.Съответно, тези, които осигуряват DARS-AS1, но без контролна РНК, показват потиснато PACT-PKR взаимодействие (Фигура 4в).Всички резултати показаха, че DARS-AS1 прекъсна PACT и PKR комуникацията.
Ко-локализация на PACT и PKR в контролни клетки или клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1, се наблюдава при използване на конфокална флуоресцентна микроскопия.Ядрата се оцветяват с DAPI.Получени са статистически резултати от 16 снимки.b Ко-имунопреципитация (co-IP) с използване на анти-PACT антитяло в клетъчни лизати на контролни SW620 клетки или клетки, свръхекспресиращи DARS-AS1.c Белязан PACT, пречистен PKR и транскрибиран in vitro с DARS-AS1 или фалшива РНК бяха инкубирани за in vitro анализ на свързване с протеин.За имунопреципитация се използват анти-флаг антитела.d Имуноблоти с посочените антитела бяха извършени в SW620 и HCT116 клетки, трансфектирани с контролна shRNA или DARS-AS1-shRNA, последвано от серумно гладуване.e Нивата на експресия на DARS-AS1 променят клетъчната чувствителност към тапсигаргин.SW620 клетки бяха трансфектирани с DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 свръхекспресионен плазмид или контролен плазмид.Клетките се третират с тапсигаргин в продължение на 48 часа и клетъчната жизнеспособност се определя с помощта на MTS реагент.f In vitro транскрибиран DARS-AS1 или фиктивна РНК и пречистен PACT бяха използвани за in vitro анализ на активиране и откриване на имуноблот.g Имуноблоти, използващи тези антитела, бяха извършени върху SW620-ctrl клетки (вляво) или клетки, свръхекспресиращи PKR мутанти (вдясно).След това тези клетки бяха трансфектирани с контролна shRNA или DARS-AS1-shRNA, последвано от серумно гладуване.h Поточната цитометрия показа, че инактивирането на мутантния PKR компенсира индуцираната от DARS-AS1 апоптоза в SW620 клетки.i Имуноблоти с посочените антитела бяха извършени в SW620 (вляво) или HCT116 (вдясно) клетки.Клетките, трансфектирани с контролна shRNA или DARS-AS1 shRNA, са лишени от серум и са допълнени със 100 nM PKR C16 инхибитор или DMSO.Мащабна лента = 5 µm.Показаните данни са средно ± стандартно отклонение от три експеримента.* p ≤ 0,05 двустранен t-тест на Student.
Обикновено се смята, че след като PACT взаимодейства с PKR17, PKR фосфорилирането при Thr451 може да бъде индуцирано.Нашите резултати показват, че нивото на PKR фосфорилиране е значително повишено в DARS-AS1 нокдаун клетки след серумно гладуване (фиг. 4d и допълнителна фигура 4а).Съответно, ние открихме, че фосфорилирането на eIF2α, основният PKR субстрат, също е значително повишено от DARS-AS1 shRNA (фиг. 4d и допълнителна фигура 4а).Thapsigargin е ER стресор, който кара ER да освобождава Ca2+.Съобщава се, че лечението с тапсигаргин индуцира експресията и активирането на PACT, който допълнително взаимодейства и активира PKR, което води до апоптоза чрез увеличаване на eIF2α фосфорилирането 18,61.Тук използвахме тапсигаргин като стимулатор на PACT/PKR пътя, за да изследваме дали DARS-AS1 може да помогне на клетките да преодолеят стреса чрез инхибиране на PACT/PKR пътя.Ние наблюдавахме, че нивото на експресия на DARS-AS1 корелира положително с клетъчната резистентност към тапсигаргин.Клетките SW620, свръхекспресиращи DARS-AS1, оцеляват по-добре, когато са третирани с тапсигаргин, докато клетките с нокдаун на DARS-AS1 стават по-податливи (фиг. 4е).В съответствие с тези резултати, свръхекспресията на DARS-AS1 намалява индуцираното от тапсигаргин PKR фосфорилиране (допълнителна фигура 4b).За разлика от това, след лечение с тапсигаргин, PKR и eIF2α бяха фосфорилирани в по-висока степен в DARS-AS1 нокдаун клетки в сравнение с контролните клетки (допълнителна фигура 4b).Интересно е, че тапсигаргин индуцира експресия на DARS-AS1 по дозозависим начин, което може да показва антистресова функция на DARS-AS1 (допълнителна фигура 4с).В допълнение, ние извършихме in vitro тестове за активиране, за да потвърдим тези наблюдения.Накратко, PKR се пречиства от клетъчни лизати с помощта на анти-PKR антитяло, след което се инкубира с рекомбинантен PACT и DARS-AS1, транскрибиран in vitro.След ензимната реакция, фосфо-PKR беше открит с помощта на WB.Нашите резултати показват, че PKR фосфорилирането е значително инхибирано от DARS-AS1, но не и от контролната РНК (Фигура 4f).Тези in vitro и in vivo резултати предполагат, че DARS-AS1 инхибира PACT-медиирано PKR активиране.В същото време, ние също наблюдавахме намаляване на възстановяването на PACT в присъствието на DARS-AS1 (Фигура 4f).Този резултат е в съответствие с резултатите от in vitro анализа на протеиново свързване (Фигура 4с) и отново илюстрира блокиращата функция на DARS-AS1 за PACT-PKR асоциация.
Ser246 и Ser287 в D3 домейна на PACT са необходими за PKR активиране при клетъчен стрес.Заместването на два серинови остатъка с аланин дава мутант PACT (mutD), който активира PKR в отсъствието на стрес, а заместването с аланин (mutA) обръща протокола.Тъй като ние демонстрирахме важността на този домейн в пряка връзка с DARS-AS1, ние генерирахме тези два PACT мутанта, за да проверим дали тези остатъци също могат да бъдат включени във взаимодействие с DARS-AS1.Интересното е, че и двата мутанта са загубили способността да се свързват с DARS-AS1 (допълнителна фигура 4d), което предполага, че пълната структура на PACT протеина може да е необходима за ефективно взаимодействие с DARS-AS1.
Освен това, нашите резултати също предполагат, че индуцираното от DARS-AS1-shRNA инхибиране на клетъчната пролиферация може да бъде частично възстановено чрез свръхекспресиране на доминантно отрицателен PACT мутант (PACTmutA) или доминантно отрицателен PKR мутант (PKRmut) (допълнителна фигура 4e. e).Свръхекспресията на доминантно-отрицателни PKR мутанти намалява PKR фосфорилирането, индуцирано от DARS-AS1 нокдаун, както и eIF2α фосфорилирането в клетки, лишени от серум (Фиг. 4g).По-важното е, че делът на апоптотичните клетки, индуцирани от нокдаун на DARS-AS1, също беше намален в клетки, свръхекспресиращи PKRmut (Фиг. 4h и Допълнителна Фигура 4g).Инхибирането на активността на PKR киназата също уврежда функцията на DARS-AS1, тъй като резултатите показват, че нокдаунът на DARS-AS1 рядко задейства PKR и eIF2α фосфорилиране, когато клетките са третирани с PKR-специфичен C16 инхибитор (Фигура 4i и Допълнителна фигура 4h).).Взети заедно, нашите резултати предполагат, че DARS-AS1 насърчава клетъчната пролиферация, поне отчасти, чрез инхибиране на PACT-медиирано PKR активиране.
За по-нататъшно изследване на ролята на DARS-AS1 в туморогенезата, ние проведохме in vivo експерименти, използвайки модел на миши ксенографт. Резултатите показват, че нокдаунът на DARS-AS1 драстично намалява растежа на тумора при мишки (р стойност <0,0001) (Фигура 5а). Резултатите показват, че нокдаунът на DARS-AS1 драстично намалява растежа на тумора при мишки (р стойност <0,0001) (Фигура 5а). Резултатите показват, че нокдаун DARS-AS1 резко намалява растежа на опухоли в миша (значение p <0,0001) (рис. 5а). Резултатите показват, че нокдаунът на DARS-AS1 драстично намалява туморния растеж при мишки (р стойност <0,0001) (Фигура 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Резултатите показват, че нокдаун DARS-AS1 значително намалява растежа на опухоли в миша (значение r <0,0001) (рис. 5а). Резултатите показват, че нокдаунът на DARS-AS1 значително намалява туморния растеж при мишки (р стойност <0,0001) (Фигура 5а).По този начин, в групата с нокдаун DARS-AS1, имаше значително намаление на средния обем на тумора с около 72,9% и средната туморна маса с около 87,8% (Фигура 5b-d).Тези резултати силно предполагат, че DARS-AS1 може значително да стимулира растежа на тумора in vivo.
Ефекти от нокдаун на ad DARS-AS1 върху колоректалната онкогенеза при голи мишки.Показани са криви на растеж (a), размер на тумора (b), тегло (c) и изображения на тумор (d).Лентите за грешки представляват ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, чрез двустранен t тест на Student. n = 10. ****p < 0,0001, чрез двустранен t тест на Student. n = 10. ****p < 0,0001 по двустранния критерий Стюдента. n = 10. ****p < 0,0001 двустранен t-тест на Student.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустранния критерий Стюдента. ****p < 0,0001 двустранен t-тест на Student.e Kaplan-Meier анализира корелацията между нивата на експресия на DARS-AS1 и общата преживяемост при пациенти с UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM и LGG.Високите нива на експресия на DARS-AS1 при пациенти са в горните 50%;ниското ниво на експресия на DARS-AS1 при пациентите е в долните 50%.p-стойностите бяха определени с помощта на теста за логаритмичен ранг.f Предложен модел, при който DARS-AS1 регулира PACT-PKR пътя и туморния растеж.
За да разберем по-добре клиничното въздействие на DARS-AS1, ние изследвахме връзката между неговата експресия и преживяемостта на пациента.Чрез анализиране на набора от данни TCGA открихме, че по-високата експресия на DARS-AS1 е свързана с увеален меланом (UVM), бъбречна хромофобия (KICH), бъбречно-папиларен клетъчен карцином (KIRP), мезотелиом (MESO), мултиплекс.По-ниската преживяемост е значително свързана с глиобластомна морфоза (GBM) и пациенти с мозъчен глиом с нисък клас (LGG) (Фигура 5е).Тези резултати предполагат, че DARS-AS1 може да играе важна роля в клиничната прогресия на тумора и може да бъде потенциален предсказващ биомаркер при множество видове рак.
В това проучване, използвайки широкомащабен CRISPRi функционален скрининг, ние установихме, че DARS-AS1 lncRNA преодолява стреса на раковите клетки чрез регулиране на две ключови реакции на стрес, PACT и PKR.Чрез директно взаимодействие с PACT, DARS-AS1 инхибира PACT-медиираната PKR активация, като по този начин предотвратява апоптотичната клетъчна смърт и насърчава клетъчната пролиферация (фиг. 5f).Повишена регулация на DARS-AS1 е наблюдавана при множество видове рак, което предполага, че неговата функция за насърчаване на оцеляването на раковите клетки при стресови условия може да бъде широко приложима за множество видове рак.
PACT е идентифициран като PKR активаторен протеин и PACT-медиираното PKR активиране играе важна роля в отговорите на стреса чрез регулиране на транскрипцията, транслацията, апоптозата и други важни клетъчни процеси62.В продължение на десетилетия са правени опити да се разбере специфичната за рака регулация на каскадата PACT-PKR.Тук нашето проучване разкри различен механизъм на регулиране на PACT-PKR в раковите клетки чрез клетъчна lncRNA DARS-AS1, която директно се свързва с PACT, блокира взаимодействието PACT-PKR, инхибира PKR активирането и eIF2α фосфорилирането, като по този начин инхибира индуцираната от стрес апоптоза и стимулиране на евентуална пролиферация на рак.клетки.Това откритие хвърля светлина върху потенциалните мишени на lncRNA за прогноза и терапия на рак.
Нашите данни показват, че нокдаунът на DARS-AS1 сенсибилизира клетките към серумно гладуване със значително увеличение на фосфорилирания PKR и eIF2α.Тези резултати предполагат, че DARS-AS1 насърчава оцеляването на раковите клетки при тежки условия чрез инхибиране на активността на PACT/PKR.Няколко други некодиращи РНК, като ASPACT и nc886, също участват в PACT/PKR оста чрез понижаване на PACT48 иРНК или регулиране на автофосфорилирането чрез свързване към PKR49, 50, 64.Сред тях DARS-AS1 действа като разрушител на асоциацията PACT-PKR.Това проучване обогатява нашето разбиране за регулирането на оста PACT/PKR и ролята на lncRNAs в реакциите на стрес.
PACT съдържа три отделни домейна.Всеки от първите два dsRBDs е достатъчен за постигане на висок афинитет на свързване на PACT към PKR, докато третият домен (D3) е необходим за PKR активиране in vitro и in vivo.Нашето проучване показа, че DARS-AS1 преференциално взаимодейства с D3 домейна (фиг. 3h).Като се има предвид големият размер на lncRNA (768 нуклеотида), свързването на DARS-AS1 към D3 може физически да инхибира взаимодействието между PACT домейна на dsRBD и PKR, като по този начин блокира свързването на PACT и PKR.Точковите мутации на PACT, които заменят Ser246 и Ser287 в D3 с аланин или аспартат, нарушават неговия афинитет на свързване към DARS-AS1, което показва важността на цялостните структурни и електрически свойства на D3 в тяхната връзка.Допълнителни подробности за този механизъм ще бъдат необходими в бъдеще, като се използва по-прецизен биохимичен анализ и PACT структурен анализ с висока разделителна способност.
Предишни проучвания съобщават, че DARS-AS1 насърчава клетъчната пролиферация чрез няколко механизма 51, 52, 53.В един пример изследователите наблюдават, че DARS-AS1 регулира своя антисензивен протеин-кодиращ DARS ген чрез насочване към miP-194-5p в ракови клетки на бъбреците.Въпреки това, в настоящото проучване, нокдаунът на DARS-AS1 има малък ефект върху транскрипцията на DARS при множество видове рак, включително най-малко рак на дебелото черво, гърдата и черния дроб.Тъй като lncRNA показват клетъчно- и тъканно-специфични модели на експресия, функционалните механизми може да не бъдат запазени при видовете рак, което може да допринесе за това несъответствие между нашите наблюдения и предишни оценки на различни видове рак.Необходими са специални изследвания за изясняване на специфичните механизми на различните физиологични и патологични процеси.
Анализ на клинични данни показа, че експресията на DARS-AS1 в тумори е обратно пропорционална на преживяемостта на пациенти с рак, което подчертава важността на оста DARS-AS1/PACT/PKR в прогнозата на рака.В заключение, нашето проучване показва, че DARS-AS1 е регулатор на PACT/PKR сигналната ос, насърчава пролиферацията на ракови клетки и инхибира апоптозата по време на реакцията на стрес, което осигурява друга линия на изследване и представлява интерес за бъдещи изследвания на потенциални лечения .
Човешки клетъчни линии SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 и HEK293T бяха получени от Националната инфраструктура за ресурси на клетъчни линии в Китай.Всички клетки се поддържат в среда DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), допълнена с 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) и 1% пеницилин-стрептомицин (Thermo Fisher Scientific) при 37°C, 5% CO2.инкубатор.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Анти-PKR, Abcam (ab184257);Анти-PKR (фосфо-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Анти-eIF2α, Abcam (A0764));анти-eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);нормален миши IgG, CST (5415S);нормален заешки IgG, CST (2729S).Антителата се разреждат 1:1000 в PBST за Western blotting и 1:100 за IP.
sgRNA са разработени с помощта на публично достъпен инструмент, наречен CRISPR-ERA66.Използвахме параметрите на инструмента по подразбиране за развитие на sgRNA и алгоритъмът изчисли местата за свързване на sgRNA в областта от 3 kb.с център TSS.Пулове от sgRNA олигонуклеотиди бяха синтезирани в CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) и клонирани в хуманизирани pgRNA плазмиди (Addgene #44248).Общо 12 µg обединен хуманизиран pgRNA плазмид, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260) и 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) бяха ко-трансфектирани в 5 х 106 HEK293T в 10 cm панички с помощта на DNAfect Transfection Reagent клетки ( CWBIO, Пекин, Китай), следвайки инструкциите на производителя.Супернатантите, съдържащи вирус, се събират 48 и 72 часа след трансфекцията и се филтруват през 0.45 цт филтър.За скрининг, SW620 клетки, експресиращи dCas9/KRAB слетия протеин, бяха получени чрез вирусна трансдукция.Модифицираните SW620 клетки бяха заразени с вирусната библиотека в четири независими експеримента за инфекция при MOI от 0.1-0.3 и бяха взети проби с 2 μg/ml пуромицин (Sigma, St. Louis, MO) в продължение на 2 дни.След това клетките се култивират в продължение на 18 дни in vitro с минимално покритие на библиотеката от 500 клетки/sgRNA за скрининг.
Геномната ДНК се екстрахира съгласно инструкциите на QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дюселдорф, Германия; 51183).Общо 100 μg геномна ДНК на биологично повторение бяха използвани за изграждане на библиотеката.Областта на sgRNA се амплифицира чрез два кръга на PCR и се свързва с баркод.
PCR продуктите се пречистват с помощта на NucleoSpin® гел и PCR комплект за пречистване (MACHEREY-NAGEL, Düren, Германия; 740609.250) и се определят количествено с помощта на Qubit™ HS двуверижен комплект за откриване на ДНК (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS анализът се използва за измерване на клетъчната пролиферация.Клетките се посяват в 96-ямкови плаки при първоначална плътност от 2000 клетки/ямка.Относителният брой клетки се измерва ежедневно в указаното време за общо 4-6 дни.За всяка ямка 20 μl MTS реагент (Promega) се разреждат със 100 μl DMEM, инкубират се с клетки в продължение на 4 часа при 37 ° С и след това се измерва OD490.
Капацитетът за незакотвен растеж беше открит чрез анализ на образуването на сфери.Накратко, 2000 клетки, трансфектирани с shRNA DARS-AS1 или контролна shRNA, бяха култивирани в микроплаки със свръхслабо прикрепване (Corning) със смяна на средата на всеки 4 дни.Сфероидите бяха преброени след 14 дни.500 клетки, трансфектирани с DARS-AS1 свръхекспресионен плазмид или контролен плазмид, бяха използвани за анализа на усилване, в противен случай методът беше непроменен.
РНК се транскрибира с помощта на Т7 РНК полимераза и биотин-16-UTP (Roche 1138908910) съгласно инструкциите на Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Използваните тук праймери са изброени в допълнителна таблица 4.
PACT или PKR региони, кодиращи протеин, се клонират в pET15b (Addgene #73619) и се трансформират в BL21(DE3).Бактериите се инкубират една нощ в LB, снабден с ампицилин и след това се разреждат 100-кратно с пресен LB.Когато OD600 на средата достигне 0.8, се добавя 1 mM IPTG за индуциране на протеинова експресия.След инкубиране в продължение на една нощ с леко разклащане (250 rpm при 20°C), клетъчната пелета се събира чрез центрофугиране (4000 rpm, 10 min, 4°C).Ресуспендирайте клетъчната пелета в лизисен буфер (50 mM Tris, рН 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) и инкубирайте върху лед за 30 минути, след това обработете с ултразвук (15 минути, 5 s включване/изключване, върху лед) и центрофугирайте (13 000 обороти в минута)., 30 мин., 4°С).След това супернатантата се зарежда върху Ni-NTA смола (QIAGEN) 3 пъти при 4°C, промива се 4 пъти с промивен буфер (50 mM Tris, рН 8.0, 40 mM имидазол, 250 mM NaCl) и се елуира 3 пъти, с общо от 10 ml елуиращ буфер (50 mM Tris, рН 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM имидазол).Пречистеният протеин се определя с помощта на WB и концентрацията се определя с помощта на комплекта за анализ на протеин Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP анализите се извършват, както е описано по-горе, с модификации.Накратко, 1x RIP буфер (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin рибонуклеазен инхибитор (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, протеаза) лизира цитостатичен 1 x 107 коктейл (Roche, 1 mM DTT) и центрофугирайте при 13 000 rpm за 15 минути при 4 °C.След това супернатантата се инкубира с протеинови A+G магнитни перли (Millipore), конюгирани с 5 μg анти-PACT антитяло (Abeam) или IgG (CST).Перлите се промиват 5 пъти с 5x RIP буфер, след което се усвояват с протеиназа К (NEB).РНК се екстрахира с Trizol и се определя чрез RT-qPCR.Праймерите са представени в допълнителна таблица 5.
In vitro RIP анализът се извършва съгласно модифициран стандартен протокол за RIP анализ.Общо 5 pmol in vitro транскрибирана РНК се разрежда 1x с RIP буфер и се отгрява чрез инкубиране при 65°C за 5 минути, последвано от бавно охлаждане до стайна температура.Общо 5 pmol интактни или мутирали белязани с флаг PACT протеини бяха пречистени от Е. coli.Инкубирайте с ренатурирана РНК за 2 часа при 4°C и следвайте горната процедура за RIP анализ за анти-флаг IP.
За анализ на РНК разширение, 1 × 107 клетки бяха лизирани с 1xRIP буфер.След центрофугиране при 13 000 rpm за 15 минути при 4 ° С, супернатантата беше предварително обработена с 30 μl стрептавидинови магнитни зърна (Beckman) в продължение на 2 часа при 4 ° С.След това пречистеният лизат се доставя с тРНК на дрожди и се инкубира с 40 pmol ренатурирана РНК за една нощ при 4 ° С, след това за още 2 часа и се добавят 20 μl нови стрептавидинови магнитни перли, блокирани с BSA.Етапът на промиване се състои от 4 пъти с 5x RIP буфер и 4 пъти с 1x RIP буфер.Съответните протеини се елуират с буфер за елуиране на биотин (25 mM Tris-HCl, рН 7.5, 12.5 mM D-биотин, PMSF) и се разделят на NuPAGE 4-12% Bis-Tris гел (Invitrogen).След оцветяване със сребро (Beyotime Biotechnology), определени ивици бяха изрязани и анализирани от MS.
Беше извършен Co-IP анализ, за ​​да се тества взаимодействието между PACT и PKR.Накратко, супернатантните лизати се приготвят чрез инкубиране на 1 х 107 лизирани клетки в 1 х RIP буфер, последвано от центрофугиране при 13 000 rpm за 15 минути при 4°C.Лизатите се зареждат с протеин A + G магнитни перли, конюгирани с 5 ug анти-PACT антитяло и внимателно се въртят за една нощ при 4°C.Перлите се промиват 3 пъти с 5 × RIP буфер, два пъти с 1 × RIP буфер и се елуират с 1 × SDS буфер.Възстановеният протеин се анализира чрез SDS-PAGE гел и се открива от WB.
Два pmol маркиран PACT и 1 pmol PKR бяха пречистени от Е. coli.Разредете в 1 × RIP буфер и инкубирайте с 10 pmol ренатурирана РНК за 2 часа при 4 °C.След това те бяха инкубирани с анти-белязано антитяло, конюгирано с протеин A+G магнитни топчета за още два часа.След това зърната се промиват четири пъти с 1x RIP буфер и се елуират с 1x SDS буфер.Получените PACT и PKR бяха открити от WB.